ＤＮＡ分离、分级分离和分析方法及其系统技术方案

将长ＤＮＡ消化成小的片段，在没有亚克隆情况下使用１６种引物的小文库进行测序。可联合使用凝胶电泳分离和与ＤＮＡ聚合酶反应结合在一起的杂交技术分离各片段，其并没有使用亚克隆方法，因此对方法的全自动化是有宜的。本发明专利技术公开的ＤＮＡ分离、分级分离和分析方法使用包括固定所说ＤＮＡ探针之固相的容器的ＤＮＡ分离和分级分离系统，以及包括为所说的容器内装添所需物质的工具、温度控制工具、样品转移工具及分级分离已分离之靶ＤＮＡ片段的工具的机器人系统。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及样品制备方法，DNA分析方法及其用于DNA序列测定或DNA分析的分离、分级分离和分析方法的系统。为了按照常规方法测定长的DNA序列，将靶DNA克隆在载体如质粒中，从而经培养而增加有广泛用途的DNA拷贝数目。为了测定所说DNA(在本文中为2—6升碱基)，(1)用限制性酶将DNA消化成较小的片段，(2)再克隆(亚克隆)后将其感染到大肠杆菌中，以及(3)将所说的大肠杆菌培养成菌落。然后经菌落筛选来分级分离DNA片段。培养增殖所选择的菌落中的大肠杆菌并提取DNA以得到包埋于质粒中之靶DNA的许多拷贝。也就是说，用限制性酶消化DNA以通过亚克隆和继后的菌落培养来纯化、分级分离和扩增DNA。如上所述，在琼脂上培养大肠杆菌以形成菌落。各菌落包含有携带质粒的大肠杆菌，质粒中则含有DNA片段的单一拷贝。从各菌落中挑取大肠杆菌并培养在试管中以增加拷贝数目。然后提取DNA用作进行序列测定的样品。为了分析各种不同的DNA片段，分析得自各不同种之菌落的DNA片段。因为有反复分析含同一DNA片段之菌落的情况，所以分析过程冗长而且常常使菌落的数目平均为不同种DNA片段数目的4倍左右。使用这样的亚克隆方法进行DNA制备可使DNA片段在一个过程中得以分离和扩增。尽管有这一优点，但该方法也有花费过多时间和劳动，并且不适于自动化操作的缺点。此外，其另一个缺点是必须重复分析同一DNA片段，因为预先不可能知道在各菌落的大肠杆菌中含有何种DNA片段。本专利技术的目的是解决现有技术的所说的问题，并提供没有使用克隆和培养的DNA分级分离、增殖和分析方法，从而取代耗费时间和不适于自动化的亚克隆及培养方法。为了实现所说的目的，本专利技术使DNA片段与配有3’末端侧有选择DNA片段之序列的1至3个碱基的DNA探针间发生杂交；从而，可根据是否发生探针DNA链延伸反应来确定可用作测定各DNA序列之引物的DNA探针。本专利技术包括使用所说的方法对DNA片段进行分级分离的方法。本文所用的术语DNA与常规定义几乎没有区别。两个或多个DNA探针的大部分序列都是一样的，只是3’末端侧的1至3个碱基不同。目的是观察是否存在互补链延伸，是否有杂交。必要时用PCR方法(聚合酶链反应)扩增DNA片段，并与所说的新建立的方法平行进行，经凝胶电泳按照DNA片段的长度进行分离和分级分离，从而完成DNA分析。如上文所讨论的，在克隆和亚克隆方法中，分级分离各个不同种的DNA片段以增加拷贝的数目。如果可用适合于自动化的便利方法代替分级分离和扩增两种方法，则对于大批量DNA序列测定将是很有帮助的。已经广泛使用PCR方法作为增加DNA片段拷贝数的手段。所以，如果在混合的条件下对各种不同的DNA片段进行分级分离或DNA序列测定，则将会解决这一问题。已经公开了一些分级分离DNA片段的手段，包括凝胶电泳分离法或在固相表面上固定寡聚体以利用有无杂交的方法。然而，凝胶电泳法不能分离有差不多相同长度的DNA片段或互补链。再者，当使用杂交法时，要根据某些相关DNA片段组是否具有特异性序列来进行鉴定；因此，并不是所有序列都能分级分离未知DNA组中的各个片段。为了解决这一问题，提出了一个其中使用在各片段末端上的几个碱基作为标志来分级分离和分析各片段的系统。也就是说，当用限制性酶消化各片段的末端时，在所有片段的切割位点处都有酶的识别序列，但是预期根据各片段不同与之相邻的1至3个碱基的序列有所不同；这一点即在所提出的方法中用来进行选择。或者当用超声波等在随机位置上消化该DNA片段时，注意到在任意选择的末端上有3至4个碱基之特异序列片段，以代替限制性酶识别序列(当选择GACT作为4个碱基时，其将以256个碱基之一的比例出现)；当利用与之相邻的1至3个碱基序列的差异鉴定和分级分离具有以这一恒定频率出现之末端序列的片段时，则按照另一种可替代的方法进行。为了认识这一点，本专利技术使用凝胶电泳法对片段进行粗略分离和分级分离。为了鉴定各部分中的DNA片段，利用了末端几个碱基的差异，在许多情况下是利用4至7个碱基的差异。在这4至7个碱基中，2至4个是限制性酶的识别序列或出现在规定间隔处的序列，而3’末端其余的1至3个碱基则用于选择。试图制备具有与该4至7个碱基部分互补之序列的DNA探针，并根据是否精确地发生杂交对其进行分级分离，没有获得成功的结果。这是因为下述原因首先，4至7个碱基杂交不能稳定地形成杂交体；其次，杂交碱基不能达到不包括一个碱基错配的准确分级分离。因此，使用迄今所用的简单DNA杂交方法不能鉴定或分离未知的DNA片段。根据这一提议，为了确保稳定的杂交，在DNA片段的3’末端加上已知序列的DNA寡聚体以延长杂交区域。另外，使在其3’末端有选择之序列的用于选择的探针与片段的3’末端杂交，并且不仅根据是否发生杂交，而且还根据杂交的DNA探针是否通过DNA互补链延长反应引起DNA链的延伸来分级分离DNA片段。对此考虑到下述事实是否发生互补链延伸取决于3’末端的1至3个碱基是否实现了完全匹配。使用上文讨论的DNA探针的DNA分析方法包括1)消化靶DNA，2)凝胶电泳后分收分离经消化的DNA片段，3)在3’末端加上寡聚体以修饰DNA片段，4)使DNA探针与该片段杂交，5)通过当探针的3’末端与片段完全匹配时发生的聚合酶反应来延伸DNA探针，6)经检测延伸的引物，确定测序引物，和/或用经过延伸的DNA探针分级分离DNA片段，以及7)使用已确定的引物测定DNA片段混合物中之DNA片段的序列，或者用经过延伸的DNA探针测定分级分离之片段的DNA序列。方法的关键是步骤(5)和(6)。例如，当选择的序列是2个碱基单体时，有16种DNA探针。将DNA样品分成16个相等的部分，并将彼此不同的DNA探针插入各部分以进行互补链延伸。除了3’末端的两个碱基外所有序列都是共有的；可与任何片段发生杂交。但只有在末端的两个碱基准确杂交时才发生有效的互补链延伸。用荧光团标记的DNA探针研究DNA探针引导延伸的能力。经凝胶电泳分析反应产生之产物的长度。因此，根据迁移速度检查长度可鉴定有DNA片段测序引物功能的DNA探针，以及DNA片段的近似长度。当用生物素标记DNA探针时，可用固定有抗生蛋白链菌素的磁珠挑出DNA片段。如果在这种情况下将温度定在摄氏80—85度，与没有互补链延伸的DNA探针杂交的DNA片段便不稳定，而离开DNA探针并被除掉。与经过延伸的DNA探针杂交的DNA片段并不从经延伸的DNA探针上离去并因而被分级分离。为了使这一方法更为有效，在固相表面上提供16个凹槽并使16种DNA探针分别固定到这些凹槽内，以形成用于本目的的检测板。当然，也可以将DNA探针固定到小珠上以代替检测板，并根据所固定的DNA的种的不同将它们包封在不同的凹槽内。也可使用不同的容器。将DNA片段混合物放在包含检测板的容器内，并使固定的寡聚体间发生杂交。这一过程后使用DNA聚合酶进行DNA探针的互补链延伸。当含有DNA探针3’末端之2个碱基的选择性序列互补于已杂交之DNA的序列时，即发生互补链延伸以确保杂交有更大的稳定性。当使温度升至80至85℃时，连接到没有经受互补链延伸之DNA探针上的DNA片段即从DNA探针上离开并被溶剂洗掉，然后除去之。如此导致只有用已本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ分离和分级分离方法，其包括：ｉ）制备检测板的操作步骤，所说的检测板中ＤＮＡ探针被固定在用于每种选择性序列的固相表面上－所说的ＤＮＡ探针包括有寡聚体，该寡聚体含有所有探针共有的序列和３’末端上用于选择片段的１至３个碱基的选择性序列， 或者将探针滞留在分有间隔的容器中的操作步骤；ｉｉ）使多个ＤＮＡ片段与所说的ＤＮＡ探针杂交的操作步骤；ｉｉｉ）通过ＤＮＡ聚合酶反应只延伸ＤＮＡ探针来稳定ＤＮＡ探针与所说的ＤＮＡ片段间之杂交体的操作步骤，所说的ＤＮＡ探针中在已知序列后的 ＤＮＡ探针３’末端侧的选择性序列互补于所说的ＤＮＡ片段相对应的序列部分；以及ｉｖ）通过在操作步骤ｉｉｉ）后的加热处理，根据杂交体稳定性的差异来分离和分级分离特异性ＤＮＡ片段的操作步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：神原秀记，冈野和宣，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]