一种荧光定量聚合酶链式反应方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种荧光定量ＰＣＲ方法。该方法的荧光ＰＣＲ反应体系中镁离子的浓度为１５－２０ｍＭ，Ｔａｑ酶用量为８－１０单位／反应；在ＰＣＲ反应前测定反应前荧光值；在ＰＣＲ反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用系列阳性和阴性模板也进行同样的步骤，制成标准曲线；用各样品的荧光增值即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。本发明专利技术还提供了一种用于该方法的试剂盒。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于核酸检测的PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)以及用于该方法的试剂盒。具体地说，本专利技术涉及用于核酸检测的荧光定量PCR方法及其试剂盒。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是基于DNA体外扩增技术来检测痕量、微量核酸的方法，已被广泛用于核酸的检测分析和遗传学测试。通过PCR过程，可以准确检出临床样本中与疾病相关的痕量DNA/RNA的存在，明确检查出致病原因，从而指导临床诊断和治疗。进一步的定量PCR结果，则可以更详细的监测临床样本中与疾病相关的痕量DNA/RNA的数量及其变化，对于临床治疗方案的选择、疗效考核有极大的指导意义，尤其适合许多源于DNA/RNA数量变化的疾病的检测和治疗。PCR方法采用一对人工合成的寡聚核苷酸引物及dNTPs为原料，在体外模拟DNA的体外复制过程，用耐高温的DNA聚合酶经多次循环，扩增模板DNA。可以将目的DNA的量扩增106～107倍，再将产物在琼脂糖凝胶上电泳，以溴乙锭(EB)染色体而显示结果。此方法具有灵敏、迅速、准确、方便等特点。但它也有相应的不足，主要可归结为3点(1)只有定性结果，无法给出临床需要的定量结果；(2)由于采用电泳检测，易引起PCR产物的交叉污染，增加了假阳性结果的可能性；(3)采用的染色剂溴乙锭是强烈致癌物，可能危害操作人员及污染环境。经过研究和改进常规PCR方法，又产生了实时定量荧光PCR方法(参见Kenneth J.Lival et al,U.S patent 5,538,848)。该技术在常规PCR基础上，添加了一条荧光标记的探针。探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变，当有特异性PCR扩增发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长(见图1)。荧光信号伴随着PCR的过程的进行，PCR产物的增长而增长。实时定量荧光PCR方法就是利用此原理，在PCR过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct值)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，根据循环参数Ct值就可以准确定出起始DNA的数量。实际使用时，是将含有荧光探针和从标本中提取的核酸样品的PCR反应管放入PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，启动PCR循环过程和荧光检测功能，后者在仪器中透过样品管盖(Eppendoff管盖)直接实现闭管检测。反应结束后，仪器将自动分析检出样品的Ct值；同时平行测定阳性梯度标准品的Ct值，用这些值制成标准曲线，再由样品的Ct值，可在标准曲线上查出相应的起始DNA量。本方法由于采用荧光技术和闭管检测，完全克服了前述常规PCR方法的3个主要缺点。但出于实时连续检测的需要，技术中必须采用昂贵的PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，如美国Perkin Elmer公司的7700型Sequence Detector，价格高达10万美元。这种情况限制了实时定量荧光PCR方法在临床诊断中的大规模应用。本专利技术的目的是为了克服上述已有荧光PCR检测方法实施费用高，使用仪器昂贵的缺点，提供一种简便、价廉、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。本专利技术的荧光PCR方法包括如下步骤a、根据待检测靶基因的特异性核酸序列合成一对引物。引物相互之间最好至少相距30个碱基；b、根据待检测靶基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列设计、合成一个荧光探针；c、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系，其中镁离子的浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应；d、从待测标本中提取DNA，或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入步骤c中的反应体系中，经离心混合后测定反应前荧光值；e、将反应管放入PCR仪进行20～50次循环的PCR反应；反应结束后再测定一次反应管中的荧光值；前后两次测值的差值即代表了本管反应的荧光增值；f、同时用系列阳性和阴性模板也进行步骤d的核酸提取和PCR反应，测得各自相应的荧光增值，将荧光增值相对于阳性模板的初始核酸量的自然对数值作图，制成标准曲线；g、用上述e步骤中获得的各样品的荧光增值，可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。在本专利技术的方法中，靶基因的特异性核酸序列是指仅存在于该靶基因中的核酸序列。该核酸序列的存在与所述靶基因的存在之间是具有一一对应的关系。本专利技术方法的PCR反应体系与常规PCR反应体系类似，包括高温聚合酶，核酸提取试剂，荧光PCR反应液，阳性模板系列，阴性模板和覆盖剂等。参见Bevan等的上述文献。高温聚合酶是指具有3’→5’DNA聚合酶活性、5’→3’DNA外切核酸活性和可耐受高温的聚合酶。所述的高温聚合酶最好是95℃半衰期＞45分钟的高温聚合酶。荧光PCR反应液是含dNTPs，缓冲体系，PCR扩增引物和荧光探针的体系。所述的PCR扩增引物是经过设计，特异性针对某一待测核酸序列的特征序列的引物，长度15～40碱基(bases)，最好是18～25碱基(bases)。所述的荧光探针是标记了两个荧光基团的DNA探针，其中一个标记在探针的5’端，另一个荧光基因和它的相距7bases或以上，两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基因所发出的荧光可被另一荧光基因吸收或抑制。探针的3’端羟基(-OH)已被去除或封闭，不具有延伸能力；长度为15～50bases；最好是18～35bases。所述的缓冲液体系是由pH=5.0～10.0之间的稳定缓冲对，Mg离子和其它促进反应的离子组成，pH值最适选择是PH=7.0～9.0。阳性模板系列，是指予先经过数量标定的阳性质控标准品。阳性模板的最好是含有已知数量目的基因的临床标本；阳性模板的另一选择是经过提取、纯化，预先测定好数量的核酸标本；阳性模板的再一选择是经过基因工程克隆、纯化和定量的目的基因。阴性模板是指阴性质控制标准品。阴性模板的较好选择是经过确证为阴性的临床标本；阴性模板的另一选择是经过提取、纯化、并经确证为阴性的核酸标本；阴性模板的再一选择是纯净H2O。在反应体系上最好用覆盖剂覆盖。覆盖剂是指用于覆盖于反应体系液面，防止蒸发，与水不相溶的油性覆盖剂。较好选择是固体或液体石蜡。本专利技术中，PCR反应最好是二步法PCR，包括变性和退火/延伸两步。变性的温度是85℃～99℃，时间10秒～300秒；退火/延伸的温度是37℃～75℃，时间是10秒～600秒，循环次数是15～60次。最好是变性温度89℃～95℃，时间20秒～120秒；退火延伸的温度50℃～70℃，时间30秒～200秒，循环次数30～50次。本专利技术中，荧光激光光是采用单色光，波长λ=300～700nm，检测波长λ=350～800nm。荧光激发光较好的波长λ=450～600nm，检测波长λ=480～650nm。本专利技术中，可定量的核酸起始拷贝数范围为1～1011拷贝/ml。可定量的核酸起始拷贝数较好的范围为103～109拷贝/ml。本专利技术还提供了一种用于荧光定量PCR方法的试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测核酸的特异性序列设计的PCR引物和荧光引物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光定量ＰＣＲ方法，包括以下步骤： ａ、根据待检测靶基因的特异性核酸序列合成一对引物； ｂ、根据待检测靶基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列设计、合成一个荧光探针； ｃ、使用步骤ａ中的引物和步骤ｂ中的荧光探针及其它ＰＣＲ成份组成荧光ＰＣＲ反应体系，其中镁离子的浓度为１５－２０ｍＭ，Ｔａｑ酶用量为８－１０单位／反应； ｄ、从待测标本中提取ＤＮＡ，或是提取ＲＮＡ然后逆转录成ｃＤＮＡ，加入步骤ｃ中的反应体系中，经离心混合后测定反应前荧光值； ｅ、将反应管放入ＰＣＲ仪进行２０～５０次循环的ＰＣＲ反应；反应结束后再测定一次反应管中的荧光值；前后两次测值的差值即代表了本管反应的荧光增值； ｆ、同时用系列阳性和阴性模板也进行步骤ｄ的核酸提取和ＰＣＲ反应，测得各自相应的荧光增值，将荧光增值相对于阳性模板的初始核酸量的自然对数值作图，制成标准曲线； ｇ、用上述ｅ步骤中获得的各样品的荧光增值，可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程钢，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]