一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一株黑曲霉M03及其在微生物转化普洱茶素中的应用。从普洱熟茶中分离得到一株能生物转化生产普洱茶素的黑曲霉M03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10930。以其为发酵菌株，采用“渥堆”固体发酵的方式以云南大叶种茶晒青毛茶为原料，或采用液体发酵的方式以儿茶素类化合物和茶氨酸为底物，进行“渥堆”固体发酵和液体发酵，生产普洱茶素类化合物。本发明专利技术能特异性地生产普洱茶素类化合物，且具有环境友好、操作简单、便于推广的特点，具有很好的应用前景。

Aspergillus niger and its application in the preparation of tea catechins

The present invention relates to Aspergillus niger M03 and its application in microbial transformation of Pu Erh tea. Get a strain of Aspergillus niger M03 can produce catechins isolated from the biotransformation of Pu'er Pu'er tea, preserved in general China center microbial microbe preservation management committee, the preservation number is CGMCC No.10930. The fermentation strains, using \wodui\ solid fermentation in Yunnan Dayezhong tea sundried green tea as raw material, or by liquid fermentation with catechins and theanine as substrate, \wodui\ solid fermentation and liquid fermentation, the production of tea catechins compounds. The invention has the advantages of environment-friendly production, simple operation and easy popularization, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用
本专利技术涉及微生物转化领域，涉及黑曲霉的应用，具体涉及一株黑曲霉及其普洱茶素类化合物的生产与生物转化中的应用。
技术介绍
普洱茶是以云南特有的大叶种茶Camelliasinensisvar.assamica(Masters)Kitamura的干燥嫩叶(习称晒青毛茶)为原料经特殊的后发酵工艺加工而成的茶叶，为著名的后发酵茶。普洱茶风味品质独特，保健功效众多，且较其他茶类效果更为显著，研究表明这与其后发酵过程密切相关。普洱茶经后发酵过程后，在微生物的酶促或非酶促作用下，所含儿茶素类成分的含量大幅降低，产生了许多有别于其他茶类的新化合物。普洱茶素类化合物是普洱熟茶中的一类特征的微生物转化产物，这类化合物具有显著的保护H2O2诱导的人血管内皮细胞损伤的活性，具有非常强的抗氧化作用。已知抗氧化活性物质具有清除自由基的作用，可以预防各种疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等。因此，该类化合物的开发利用价值高，市场前景广阔，且普洱茶素类化合物的生物合成对于研究普洱茶的后发酵机理、进而揭示普洱茶功效优于其他茶类的物质原因具有非常重要的意义。但是，普洱茶素类化合物在普洱茶中的含量低。如要进行化学合成，则存在难度大、产率低、消耗大量有机溶剂、污染环境等缺点。生物转化是指利用生物有机体(细胞、细胞器、组织等)或者酶作为催化剂进行化学转化的过程，因其具有作用条件温和、独特、高效的底物选择性等特点，广泛应用于天然产物的生物合成、手性药物的不对称合成等领域。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是，提供一种用于生产普洱茶素类化合物的新型黑曲霉菌株，利用该菌株对晒青毛茶进行“渥堆”固体发酵以及以儿茶素类化合物和茶氨酸为底物进行液体发酵，可以生成或生物转化成普洱茶素类化合物。本专利技术的另一个目的是，提供一种采用该菌株发酵生产或生物转化普洱茶素类化合物的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本专利技术提供了一株黑曲霉(Aspergillusniger)M03，其是从普洱熟茶中筛选得到的野生菌株，该菌株已于2015年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10930。该菌具有如下性质：形态特征：PDA平板上28℃培养1天为白色菌丝，培养2天形成黑色产孢区，培养4天后菌落直径为50-60mm；菌株分生孢子头呈球形，黑色，孢子梗壁厚，光滑，无色；足细胞壁厚，呈“L”型。另一方面，本专利技术提供所述黑曲霉M03在普洱茶素类化合物的制备中的应用。其中，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵或液体发酵进行。本文所述的普洱茶素类化合物的结构如通式I所示：其中R1可以为-OH或没食子酰基()；R2和R3可以各自独立地为H、-OH或N-乙基吡咯烷酮基()，并且所述N-乙基吡咯烷酮基C5’的构型可以是R或S；R4可以为-OH或H；并且通式I中的C2和C3的构型可以是R和/或S。优选地，所述普洱茶素类化合物可选自下述式I至式XII所示化合物中的一种或多种：本专利技术中也将上述化合物分别称为普洱茶素I至XII。优选地，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵进行，其中固体发酵为晒青毛茶的“渥堆”后发酵；或者优选地，所述制备通过所述黑曲霉M03的液体发酵进行，其中液体发酵以儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行。又一方面，本专利技术提供一种制备普洱茶素类化合物的方法，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵或液体发酵；优选地，所述普洱茶素类化合物选自式I至式XII所示化合物中的一种或多种。优选地，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵，并包括以下步骤：将所述黑曲霉M03添加到潮水的晒青毛茶中进行发酵；所述方法优选包括以下步骤：取所述黑曲霉M03的种子液，按照种子液与茶的质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次。进一步优选地，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105～1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在30-40℃、160-240rpm下培养18-30h，按照种子液与茶的质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次；更优选地，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在35℃、200rpm下培养24h，按照质量百分比为2％的比例将菌丝均匀地添加到以35％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在40℃、湿度为75％的条件下“渥堆”后发酵28d，每间隔7d翻堆一次。或者优选地，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行液体发酵，并包括以下步骤：将所述黑曲霉M03与儿茶素类化合物和茶氨酸在液体培养条件下进行发酵；优选地，所述方法包括以下步骤：将所述黑曲霉M03的种子液接种至发酵培养基中，加入儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行发酵，其中发酵培养基的组成为：葡萄糖15-20g/L，酵母浸出粉1.5-2.0g/L，硝酸铵10-13.5g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸氢二钾1.0-1.5g/L，pH为5.5-6.5；所述儿茶素类化合物为普洱茶中的黄烷-3-醇类化合物；优选地，所述儿茶素类化合物选自儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种，优选地选自儿茶素、表儿茶素和没食子儿茶素中的一种或多种；优选地，所述方法包括以下步骤：将所述黑曲霉M03的种子液按照1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h。进一步优选地，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105-1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；2)液体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液按照1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h；更优选地，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢本文档来自技高网...

【技术保护点】
黑曲霉(Aspergillus niger)M03，保藏编号为CGMCC No.10930。

【技术特征摘要】
1.黑曲霉(Aspergillusniger)M03，保藏编号为CGMCCNo.10930。2.权利要求1所述的黑曲霉M03在普洱茶素类化合物的制备中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵或液体发酵进行。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述普洱茶素类化合物的结构如通式I所示：其中R1为-OH或没食子酰基R2和R3各自独立地为H、-OH或N-乙基吡咯烷酮基并且所述N-乙基吡咯烷酮基中C5’的构型是R或S；R4为-OH或H；并且通式I中C2和C3的构型是R和/或S；优选地，所述普洱茶素类化合物选自下述式I至式XII所示化合物中的一种或多种：5.根据权利要求2至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵进行，其中固体发酵为晒青毛茶的“渥堆”后发酵；或者，所述制备通过所述黑曲霉M03的液体发酵进行，其中液体发酵以儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行。6.一种制备普洱茶素类化合物的方法，所述方法包括采用权利要求1所述的黑曲霉M03进行固体发酵或液体发酵，其中所述普洱茶素类化合物的结构如权利要求4中限定的通式I所示；优选地，所述普洱茶素类化合物选自权利要求4中限定的式I至式XII所示化合物中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵，并包括以下步骤：将所述黑曲霉M03添加到潮水的晒青毛茶中进行发酵；优选地，所述方法包括以下步骤：取所述黑曲霉M03的种子液，按照质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105～1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在30-40℃、160-240rpm下培养18-30h，按照质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次；优选地，所述方法包括以下步骤：1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：屠鹏飞，姜勇，叶静，王伟楠，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11