一种体外蛋白质合成的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种酵母细胞提取液的制备方法、酵母细胞提取液和利用所述的酵母细胞提取液在体外体系中合成蛋白质的方法，以及含有所述的酵母细胞提取液的试剂盒，该试剂盒可以用于体外体系中蛋白质合成，比传统方法简便；无需转化、培养、破碎；节省大量使用时间和成本；可表达的蛋白质种类多,不受蛋白毒性影响；可表达多种蛋白质复合物，无需37℃高温。另外，本发明专利技术的中所使用的原料酵母细胞，培养简单，操作方便，繁殖迅速，成本较低，制备得到的酵母提取物具有蛋白质翻译后修饰的能力，适合大规模制备，具有工业生产的优势；采用真空冷冻干燥法把酵母细胞提取物制成冻干粉低温或常温保存，便于运输。

Reagent kit for in vitro protein synthesis and preparation method thereof

The present invention provides extract in vitro system in protein synthesis method for extracting liquid yeast yeast cell preparation, yeast extract and the use of the yeast cells, and containing the liquid extraction kit, the kit can be used for protein synthesis in vitro system, compared with the traditional method simple; without conversion, training, breaking; save a lot of time and cost can be used; the expression of the protein species, without protein toxicity; the expression of several protein complexes, without a temperature of 37 degrees centigrade. In addition, the raw material of yeast cells, use of the invention in the cultivation of simple, convenient operation, low cost, rapid reproduction, yeast extract prepared with protein translation ability after modification, and is suitable for large-scale production, has the advantages of industrial production; a vacuum freeze-drying method to yeast cells made from the extract of freeze-dried powder at low temperature save or at room temperature, easy to transport.

【技术实现步骤摘要】
一种体外蛋白质合成的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及用于体外蛋白合成(invitroproteinsynthesis)的酵母细胞提取液的制备方法、酵母细胞提取液和利用所述的酵母细胞提取液在体外体系中合成蛋白质的方法，以及含有所述的酵母细胞提取液的试剂盒，该试剂盒可以用于体外体系中蛋白质合成，属于生物

技术介绍
传统的蛋白表达是指通过细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的生物学技术。随着科学技术的发展，蛋白质相关的前沿领域逐渐兴起，体外蛋白合成系统应运而生，其是以外源mRNA或者DNA为模板，在RNA聚合酶及转录因子等组分作用下合成相应的mRNA，通过在体系内加入氨基酸、ATP和GTP完成蛋白质翻译的体外系统[1]。体外翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变，可以并行检测多种基因模板，也可同时加入多个模板，可以研究多种蛋白质的复合物和之间的相互作用[2-3]。体外翻译系统也可以对基因产物进行特异性标记，产生特定改造的蛋白质产物，或便于在反应混合物中检测[4]。另外，体外翻译系统中表达蛋白质可以不需要先进行克隆，无需构建表达细胞宿主。因此体外蛋白合成系统是一种快速的蛋白质表达和鉴定系统。目前，已经商业化的体外蛋白表达系统有大肠杆菌系统(E.coliextract，ECE)[5]、兔网织红细胞(Rabbitreticulocytelysate，RRL)[6]、麦胚(Wheatgermextract,WGE)[7]、昆虫(Insectcellextract,ICE)[8]和人源系统[9]。除此以外还有链霉菌Streptomycetaceae[10]、利什曼锥虫Leishmaniatarentolae[11]、爪蟾卵母细胞Xenopuslaevis[12]、拟南芥Arabidopsisthaliana[13]，家蚕BombyxmoriLinnaeus［14］等系统报道。其中，大肠杆菌系统由于其价格低、制备易、表达量高三大优点成为目前为止最普遍使用的系统。在其基础上构建了只包含最基本转录翻译功能的PURE系统，大大降低了非目标蛋白质的表达量[15]。相对于原核系统，大多数种类的真核细胞具有可以表达复杂蛋白以及实现一些翻译后修饰的优势[16,19]。真核体外蛋白表达系统中WGE、RRL和ICE系统最为常见。WGE是用小麦胚芽制备而成[17-18]，在真核系统中产量最高，但是缺乏糖基化等翻译后修饰手段。RRL和ICE系统具有异戊二烯化[19-20]、乙酰基化[21-22]、磷酸化[23]、信号肽和泛素化处理[24]和核糖基化[25]等翻译后修饰手段。总体而言，这些真核细胞的培养难度大，花费高，其细胞抽提物的制备过程繁琐，因而它们翻译系统成本较高、只适合一般实验室操作。因此，适合工业大规模（吨级）制备和生产的真核体外蛋白表达系统目前尚不存在。作为单细胞的真核生物，酵母(yeast)兼具培养简单、高效蛋白质折叠、和翻译后修饰的优势［26]。其中酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕氏酵母(Pichiapastoris)是表达复杂真核蛋白质和膜蛋白的模式生物［27］。酵母也可作为制备体外翻译系统的原料。近年来，酿酒酵母体外翻译系统已被用来进行多种哺乳动物病毒的mRNA的翻译研究［28-29］,呈现出与其它真核体外翻译系统类似的活性，而且酵母细胞，培养简单，操作方便，繁殖迅速，成本低［29]。克鲁维酵母（Kluyveromyces）是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）和乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）是工业上广泛使用的酵母[30]。乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳糖作为其唯一的碳源和能源的酵母[31-32]。与其他酵母相比,乳酸克鲁维酵母具有许多优点,如超强的分泌能力,更好的大规模发酵特性、食品安全的级别及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等［33-37]。其作为宿主系统表达药用蛋白也已显示出巨大的潜力［37-38]。因此工业乳酸克鲁维酵母体外翻译系统有望比其他翻译系统更适合成为研究基因表达和调控的理想工具。目前，克鲁维酵母体外蛋白合成系统尚不存在。
技术实现思路
本专利技术提供一种体外蛋白质合成的试剂盒及其制备方法，以克服现有技术所存在的缺陷和不足。本专利技术的第一个目的是提供一种酵母提取物的制备方法，本专利技术的第二个目的是提供一种体外蛋白质合成的试剂盒。本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：作为本专利技术的第一方面，一种酵母提取物的制备方法，具体包括以下几个步骤：a)挑取酵母单菌落，接种于YPD培养基中；b)在OD600=3.0-6.9时，离心收获酵母细胞；c)菌体收获后采用BufferA进行重悬，重悬2-4次；d)菌体采用高压破碎或者搅拌机液氮破碎；e)把步骤d中收获的酵母细胞提取物进行离心2-4次，离心力在30000-100000×g；f)离心后，取中间层的酵母细胞提取物，除去分子量不超过2KDa的胞内组分，并将所得溶液浓缩，分装；g)液氮速冻，-80℃保存；h)或液氮速冻后，使用冷冻干燥机干燥，冻干粉低温或室温密闭保存。在本专利技术中，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母。其中，高压破碎时，压力值为500-1400bar，菌体与BufferA的比例为2g:1mL。其中，所述BufferA由20-30mMpH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾,100-200mM醋酸钾，1-2mM醋酸镁，2mM二硫苏糖醇，0.5mM苯甲基磺酰氟组成。其中，搅拌机液氮破碎时，搅拌时间为8min。其中，用于体外蛋白合成的酵母细胞提取液,包括使用上述步骤b-h任一项的酵母细胞提取液。作为本专利技术的第二方面，一种体外蛋白质合成的试剂盒，所述试剂盒包含一个体外蛋白质合成反应体系，该反应体系包括：酵母细胞提取物，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，醋酸钾，醋酸镁，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)，氨基酸混合物，磷酸肌酸，二硫苏糖醇（DTT），磷酸肌酸激酶，RNA酶抑制剂，阳性对照品，荧光素。其中，所述酵母提取物，在体外蛋白质合成反应体系中所占体系为50-70%。其中，所述阳性对照品为萤火虫荧光素酶基因的mRNA,其浓度在40-100ng/µL，其mRNA对应的DNA序列为SEQIDNO.1。其中，所述体外蛋白质合成体系中含有22mM、pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-240mM醋酸钾，0.5-4.0mM醋酸镁，0.75mM腺嘌呤核苷三磷酸，0.1mM鸟嘌呤核苷三磷酸，25mM磷酸肌酸，1.7mM二硫苏糖醇。其中，所述体外蛋白质合成体系中磷酸肌酸激酶的浓度为0.27mg/mL，RNA酶抑制剂的浓度为200U/mL。其中，所述体外蛋白质合成体系中的氨基酸混合物为下列20种氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，20种氨基酸的浓度分别为0.04mM。其中，所述体外蛋白质合成体系中的反应温度为20℃，反应时间为4h。本专利技术的有益效果是：本专利技术的试剂盒可以用于体外体系中蛋白质合成，比传统本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外蛋白质合成试剂盒中酵母细胞提取液的制备方法，具体包括以下几个步骤：a)挑取酵母单菌落，接种于YPD培养基中；b)在OD600=3.0‑6.9时，离心收获酵母细胞；c)菌体收获后采用Buffer A 进行重悬，重悬2‑4次；d)菌体采用高压破碎或者搅拌机破碎；e)把步骤d中收获的酵母细胞提取物进行离心2‑4次，离心力在30000‑100000× g；f)离心后，取中间层的酵母细胞提取物，除去分子量不超过2 KDa的胞内组分，并将所得溶液浓缩，分装；g)液氮速冻，‑80℃保存；h)或液氮速冻后，使用冷冻干燥机器冻干, 制成水分<5%的干粉后，密闭低温或室温保存。

【技术特征摘要】
1.一种体外蛋白质合成试剂盒中酵母细胞提取液的制备方法，具体包括以下几个步骤：a)挑取酵母单菌落，接种于YPD培养基中；b)在OD600=3.0-6.9时，离心收获酵母细胞；c)菌体收获后采用BufferA进行重悬，重悬2-4次；d)菌体采用高压破碎或者搅拌机破碎；e)把步骤d中收获的酵母细胞提取物进行离心2-4次，离心力在30000-100000×g；f)离心后，取中间层的酵母细胞提取物，除去分子量不超过2KDa的胞内组分，并将所得溶液浓缩，分装；g)液氮速冻，-80℃保存；h)或液氮速冻后，使用冷冻干燥机器冻干,制成水分<5%的干粉后，密闭低温或室温保存。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：高压破碎时，压力值为500-1400bar，菌体与BufferA的比例为2g:1mL。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：所述BufferA由20-30mMpH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾,100-200mM醋酸钾，1-2mM醋酸镁，2mM二硫苏糖醇，0.5mM苯甲基磺酰氟组成。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：搅拌机破碎，搅拌时间为8min。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：用于体外蛋白合成的酵母细胞提取液,包括使用权利要求1中b-h任一项的酵母细胞提取物。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：酵母细胞提取物反复冻融后，不损失体外蛋白合成的活性。8.一种采用如权利要求1所述的酵母提取物的体外蛋白质合成的试剂盒，其特征是：所述试剂盒具有一体外蛋白质合成反应体系，该反应体系包括：酵母细胞提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，符雷，柴智，刘帅龙，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31