藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法技术

本发明专利技术公开了一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，选用CHAPS作为表面活性剂，蛋白酶抑制剂选用蛋白酶抑制剂混合物，DTT作为还原剂，并将DTT的浓度由65 mmol/L增至100 mmol/L，另外，增加70 mmol/L Tris，以为二硫键的还原提供适宜的环境，抑制某些蛋白酶的活性和增加某些蛋白质的溶解度。该方法获得的绵羊卵巢全蛋白质含量、斑点数高于其他方法，凝胶图谱的匹配率和分辨率较高，矩形区域和椭圆形区域内蛋白质斑点数均较多，符合绵羊卵巢蛋白质提取的要求。本发明专利技术结合人类及模式动物卵巢提取方法，筛选出直接裂解法对绵羊卵巢全蛋白进行提取，从而获得最适的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法，对研究藏系绵羊起到极大的促进作用。

【技术实现步骤摘要】
藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。
技术介绍
哺乳动物，如藏系绵羊的产羔（仔）数是受排卵数控制的，卵泡发育和排卵的主要场所是卵巢。卵巢是雌性动物位于子宫两侧的一对卵圆形的生殖器官，其主要功能是产生卵子以及类固醇激素。卵巢外部为上皮组织和薄层的结缔组织，内部可分为皮质和髓质，皮质位于周围部分，主要由卵泡和结缔组织构成，髓质位于中部，由疏松结缔组织构成，其中有许多血管、淋巴管和神经，组成结构复杂。蛋白质样品的制备是双向凝胶电泳技术中一个复杂且关键的过程，蛋白质样品来源千差万别，样品形态不一，因而从蛋白质样品的匀质化，到干扰杂质的去除，再到所需蛋白质的收集，至今还没有标准化的研究方法。不同的物种和组织间蛋白质组成及含量差异很大，适用于不同物种和组织蛋白质提取的方法不尽相同。藏系绵羊卵巢结构复杂，富含脂类及其他干扰物质，对于卵巢蛋白质提取方法的研究主要集中在人及模式动物，但到目前为止，尚未建立一种标准化的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供有效的、标准化的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS（w/v），0.5%两性电解质pH3-10（v/v），65mmol/LDTT（w/v），10μL/mLPMSF；在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2%CHAPS（w/v），2%TritonX-100（v/v），0.5%两性电解质pH3-10（v/v），65mmol/LDTT（w/v），10μL/mL蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4%CHAPS（w/v），0.25%两性电解质pH3-10（v/v），100mmol/LDTT（w/v），70mmol/LTris，10μL/mL蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；3）、4℃静置30min；4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；6）、采用2-Dclean（Bio-Rad）试剂盒进行样品处理；7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在-80℃冰箱中备用；所述PBS缓冲液的pH为7.4。在步骤4）中，超声顺序：累计超声60s，超0.1s，停1s。在裂解液配方中，选用CHAPS作为表面活性剂，蛋白酶抑制剂选用蛋白酶抑制剂混合物，DTT作为还原剂，具有抗氧化作用，可以保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶的活性。此法中将DTT的浓度由65mmol/L增至100mmol/L，这样可以补偿IEF过程中碱性端DTT的损耗，提高对碱性蛋白的溶解。Tris有很高的缓冲能力，增加70mmol/LTris，可以为二硫键的还原提供适宜的环境，抑制某些蛋白酶的活性和增加某些蛋白质的溶解度。此配方获得的凝胶图谱相比于直接裂解法Ⅱ分辨率得到提高，说明增加DTT浓度有助于碱性蛋白的溶解。此配方获得的绵羊卵巢全蛋白质含量、斑点数高于其他方法，凝胶图谱的匹配率和分辨率较高，矩形区域和椭圆形区域内蛋白质斑点数均较多，符合绵羊卵巢蛋白质提取的要求。作为另一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；采用TCA/丙醇沉淀法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；2）、取0.1g绵羊卵巢组织样品加入1.5mL10%TCA/丙酮（w/v,含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL），涡旋振荡1min后在冰上用22%振幅细胞超声破碎仪震荡，超声顺序：累计60s，超0.1s，停1s，4℃过夜；3）、将样品在4℃，14000r/min离心30min，弃上清留沉淀；4）、沉淀加入1mL预冷的丙酮，该丙醇含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL，吹打洗涤后4℃静置20min，并在4℃，14000r/min离心20min，弃上清留沉淀；5）、重复步骤4）；6）、沉淀加入1mL90%预冷的丙酮（v/v，超纯水配制，含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL），吹打洗涤后4℃静置20min，并在4℃，14000r/min离心20min，弃上清留沉淀；7）、重复步骤6）；8）、将沉淀置于冷冻抽干机中冻干；9）、将冻干后的样品粉末按照1:10（w/v）加入不含溴酚蓝的水化上样液，涡旋振荡2min后置于4℃下裂解2h，每静置30min，涡旋振荡2min；10）、裂解完毕后，样品在4℃，14000r/min离心30min，取上清；11）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装并保存在-80℃冰箱中备用。本专利技术的有益效果在于，双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究差异蛋白质组学的方法之一，2-DE的原理是根据蛋白质的等电点和分子量将样品中的蛋白质分离成单个的蛋白质点，为进一步分析研究蛋白质的生物学作用奠定基础。因此，改善双向电泳图谱中蛋白质斑点的数目和分辨率可以提高整个试验的信息完整性。随着疏水性蛋白质提取方法的改进、高丰度和低丰度蛋白质分离提取方法的应用、蛋白染色方法水平的提高和窄pH范围胶条的应用，从蛋白溶解、染色方法和等电聚焦载体等方面为提高双向电泳的分辨率提供了新的思路。本专利技术结合人类及模式动物卵巢提取方法，筛选出直接裂解法对绵羊卵巢全蛋白进行提取，并对直接裂解法进行优化，从而获得最适的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法，对研究藏系绵羊起到极大的促进作用。附图说明图1为不同提取方法提取藏系绵羊卵巢全蛋白2-DE图谱，其中，横坐标为IEF3→10（即pH从3到10），纵坐标为SDS-PAGE（分子量由上到下为从大到小），T为TCA/丙酮法2-DE图谱，Ⅰ为裂解液法Ⅰ法2-DE图谱，Ⅱ为裂解液法Ⅱ法2-DE图谱，Ⅲ为裂解液法Ⅲ法2-DE图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但这并不意味着对本专利技术的任何限制。一、样品来源本专利技术供试羊只为成年健康经产藏母羊。羊只采用颈动脉放血法屠宰，宰后立即取卵巢并用PBS缓冲液（pH7.4）冲洗干净表面血液和其他杂质，放入5mL冻存管中，液氮带回实验室，-80℃冰箱保存备用。二、样品制备TCA/丙酮沉淀法：1）、将藏系绵羊卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末。2）、0.1g绵羊卵巢组织样品加入1.5mL1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于‑80℃低温下保存备用；采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.5% 两性电解质pH 3‑10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL PMSF；在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2% CHAPS（w/v），2% Triton X‑100（v/v），0.5% 两性电解质 pH 3‑10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.25% 两性电解质 pH 3‑10（v/v），100 mmol/L DTT（w/v），70 mmol/L Tris，10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；3）、4℃静置30min；4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；6）、采用2‑D clean（Bio‑Rad）试剂盒进行样品处理；7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在‑80℃冰箱中备用。...

【技术特征摘要】
1.一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS（w/v），0.5%两性电解质pH3-10（v/v），65mmol/LDTT（w/v），10μL/mLPMSF；在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2%CHAPS（w/v），2%TritonX-100（v/v），0.5%两性电解质pH3-10（v/v），65mmol/LDTT（w/v），10μL/mL蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4%CHAPS（w/v），0.25%两性电解质pH3-10（v/v），100mmol/LDTT（w/v），70mmol/LTris，10μL/mL蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；3）、4℃静置30min；4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；6）、采用2-Dclean（Bio-Rad）试剂盒进行样品处理；7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在-80℃冰箱中备用。2.根据权利要求1所述的藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾建磊，赖勇，陈倩，任龙，丁强，侯生珍，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海,63