本发明专利技术公开了一株从红豆杉科巴山榧树的组织中分离筛选出的产紫杉醇的内生菌，经过分类鉴定命名为黄曲霉BP6T2，保藏编号为CCTCC NO:M2016318。该菌株具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，发酵液中提取物含量可达93mg/L，其中紫杉醇的相对百分含量为8.4%，产量为7.81mg/L，高于现有技术已公开的产量；采用CCK‑8试剂法证明了黄曲霉BP6T2的发酵液提取物对Hela肿瘤细胞的抑制作用，抑制率可达到66.20%。
Aspergillus flavus BP6T2 producing taxol and application thereof
The present invention discloses a strain isolated from the production of taxol from Taxus Torreya fargesii tissues of endophytic bacteria, named after the classification and identification of aflatoxin BP6T2 and the preservation number is CCTCC NO:M2016318. The strains with anti Staphylococcus aureus and Escherichia coli activity in fermentation broth extract content up to 93mg/L, the relative content of paclitaxel was 8.4%, the yield of 7.81mg/L, higher than the prior art published by CCK yield; 8 reagent method to prove that the inhibitory effect of fermentation broth extracts of aflatoxin BP6T2 on Hela the tumor cells, the inhibition rate reached 66.20%.
【技术实现步骤摘要】
一株产紫杉醇的黄曲霉BP6T2及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种从巴山榧树中分离出的黄曲霉BP6T2，该菌株具有高产紫杉醇的特性，还涉及黄曲霉BP6T2在治疗肿瘤细胞中的应用。
技术介绍
紫杉醇(Paclitaxel)别名泰素、紫素、特素，分子量853.92，分子式C47H51NO14(图1)，是细胞有丝分裂抑制剂，被用于癌症治疗(WaniMC,TaylorHL,WallME,etal.Plantantitumoragents.VI.Theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JAmChemSoc,1971,93:2325～2327.)。紫杉醇及其类似物被认为是高效、广谱、低毒性的抗癌药物，尤其是目前治疗卵巢癌、子宫癌和乳腺癌最好的药物，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。它是一种高效细胞毒素，与已上市的其它化学合成抗肿瘤剂或植物抗癌药相比，具有独特的抗癌机理。它特异性结合于分裂中的细胞如癌细胞的维管束蛋白，尤其是β－微管蛋白上，促进微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白稳定，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，抑制细胞有丝分裂，从而阻止癌细胞的增殖，因而使肿瘤体积逐渐缩小，而不是直接杀死癌细胞。在肿瘤细胞中，紫杉醇可诱导促凋亡基因，如Bax，p53和p21，C-Mos，TNF-α等的表达而诱发凋亡。还发现紫杉醇可增强酪氨酸激酶的磷酸化，激活细胞凋亡的信号转导途径，促进细胞凋亡。紫杉醇还可调节机体的免疫功能，促进IL-1，IFN-α和IFN-β、INF-α等的分泌和释放，对肿瘤细胞起杀灭或抑制的作用。紫杉醇最早于1967年在美国国家癌症研究所被发现，上世纪五十年代末，美国国家癌症研究所制定了一项从全美植物中筛选抗癌活性物质的庞大计划。受该计划资助，MonroeE.Wall和MansukhC.Wani于1963年从太平洋红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮中提取出紫杉醇粗提物。1966年，紫杉醇得到纯化，并确定了它的结构。随后证明其具有较高的抗B16黑色瘤活性。1979年，Schiff和Horwitz阐明了紫杉醇特异性结合于分裂中的细胞如癌细胞。至1992年12月29日，美国食品药品管理局(FDA)才批准Bristol-Myers-Squibb(BMS)公司将紫杉醇上市，商品名为Taxol，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌。但是红豆杉属等植物中紫杉醇含量极低，仅有0.003％-0.069％。即治疗1个癌症病人所需要的紫杉醇的量为需要砍掉3株生长60年的红豆杉树，或1株千年红豆杉的树皮方可获取。每提取1kg紫杉醇，要砍伐大约2000棵百年大树。并且它的自然资源红豆杉和东非罗汉松均生长十分缓慢，数量有限，很难满足人类的需要，因此其价格非常昂贵。即便采伐全部的天然资源，也只能满足短期需要，且造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失。因此，紫杉醇原料的保障就成为该药能否成功走向市场的关键因素。为了解决某些药用植物生长缓慢、资源紧张等因素带来的药源紧张和生态破坏问题，人们也一直在尝试利用其它的方法生产紫杉醇，诸如化学合成法，半化学合成法，细胞组织培养等，其主要特点如下：(1)化学全合成紫杉醇方法获得了成功，但整个过程非常昂贵，而且产量不高，并非一个理想途径。(2)半合成虽然有效，但从植物组织中分离纯化半合成前体亦较为困难。(3)植物组织培养需要的步骤较为简单，但紫杉醇产量较低，产量不稳定。产紫杉醇或类似物内生真菌的分离是近年来发展起来的一种有效解决紫杉醇资源问题的新途径。通过微生物发酵的方法大量生产紫杉醇，有望改善目前紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。即使其产量与植物中紫杉醇含量相当或略低，但由于真菌发酵周期短(10～15天)，发酵规模可以人为控制，其生产能力一定大大优于植物材料的生产能力。因此，寻找可以产生紫杉醇的植物内生真菌，通过微生物发酵的方法大量生产紫杉醇，有望改善目前紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。植物内生菌广泛存在于几乎各种植物中，在长期的进化过程中，它们与植物宿主之间形成了和谐的生态关系。宿主为它们提供相对稳定的环境，而内生菌则赋予宿主抗菌、抗病毒、抗干旱及抗虫等特性。通过长期的共同进化，可能在某些药用植物的内生菌中也能够产生与宿主相同或相似的药用活性物质。因此许多药用植物的内生真菌研究受到了广泛的关注，包括产紫杉醇或类似物的植物内生真菌的分离研究也同样受到了广泛的关注。1993年，Stierle等首次从短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的韧皮部中分离出一种新的内共生真菌——安德鲁紫杉菌(Taxomycesandreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物，表明有的内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力。此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作。Li等从秃柏(Taxodiumdistichum)的树皮下韧皮部和木质部中都分离到产紫杉醇的内生真菌(Pestalotiopsismicrospora)。Strobel等从西藏红豆杉(T.wallachiana)中分离到一株产生紫杉醇的内生真菌小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)，这种真菌的培养液可以产生紫杉醇的量达到50μg/L；此后又分离到尼泊尔盘端鹿角菌(Seimatoantleriumnepalense)，其真菌培养液产生紫杉醇的量为62～80ng/L。这说明产紫杉醇的内生真菌不仅存在于红豆杉属植物中，在一些非红豆杉属植物中也存在，进一步扩大了产紫杉醇内生真菌的筛选范围。我国学者在分离产紫杉醇内生真菌的研究中也取得了一定的成果。1994年，邱德有等从云南红豆杉(T.yunnanensis)树皮中分离出一种内生真菌YFI，形态类似于Stierle发现的安德鲁紫杉菌，经过TLC分析测定，表明亦可产生紫杉醇，但是生物合成量很低。周东坡等从东北红豆杉(T.cuspidase)中发现一种内生真菌——树状多节孢(Nodulisporiumsp.)，可以产生紫杉醇，是我国的新记录属，产量为51.06～125.7μg/L。王伟等从南方红豆杉(T.chinensisvarmairei)的主干和侧枝树皮及皮下部分分离得到9株内生菌，其中6株能分泌紫杉烷类化合物，经鉴定分别属于头孢霉属(Cephalosporiumsp.)、轮柄梳霉属(Martensiomycessp.)和无孢菌(Myceliasterlia)。代文亮等也从中国南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇内生真菌，经鉴定为镰刀菌属(Fusariummairei)，产量约20μg/L。由于野生型真菌产紫杉醇或类似物的含量普遍偏低，为了提高其产量，目前的研究主要集中在以下几个方面：如利用常规诱变改良菌种(周东坡，平文祥,孙剑秋等.紫杉醇产生菌分离的研究[J].微生物学杂志，2001，21(1)：18～21.)；利用原生质体诱变改良菌种(赵凯，平文祥,马玺等，紫杉醇高产菌株的原生质体诱变选育及其遗传变异初探，微生物学报，2005,45(3)，355-35本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产紫杉醇的内生菌，其特征在于：所述的内生菌为黄曲霉BP6T2，保藏编号为CCTCC NO：M2016318。
【技术特征摘要】
1.一株产紫杉醇的内生菌，其特征在于：所述的内生菌为黄曲霉BP6T2，保藏编号为CCTCCNO：M2016318。2.根据权利要求1所述的内生菌，其特征在于：所述的内生菌具有产紫杉醇的特性，发酵液中紫杉醇的含量达到7.81mg/L。3.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹军卫，涂毅，金卫华，
申请(专利权)人：曹军卫，武汉东湖学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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