一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株及其应用制造技术

一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。本发明专利技术筛选的菌株，分类命名为米根霉(Rhizopus oryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2016565。本发明专利技术从酒曲中筛选获得了高产γ‑氨基丁酸的米根霉株Q1。该菌株在含有0.5％谷氨酸钠的发酵培养基中培养5天后，γ‑氨基丁酸产量为1.08mg/g，淀粉酶活力为150.2U/g。本发明专利技术为微生物发酵产γ‑氨基丁酸提供了基础。

A strain of high gamma aminobutyric acid Rhizopus oryzae strain and its application

The breeding of high gamma aminobutyric acid Rhizopus oryzae strain strain, which belongs to the biological engineering technical field in fermentation. The screening of strains, classification named Rhizopus oryzae (Rhizopus Q1, oryzae) in October 17, 2016 is preserved in Chinese type culture collection center, the preservation number is CCTCC M2016565. The present invention from yeast were screened by Rhizopus oryzae strain Q1 producing gamma aminobutyric acid. The strains in the fermentation medium containing 0.5% sodium glutamate after 5 days of culture, gamma amino butyric acid yield was 1.08mg/g, amylase activity was 150.2U/g. The invention provides a basis for the fermentation production of microbial gamma aminobutyric acid.

【技术实现步骤摘要】
一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌株及其应用
本专利技术涉生物
，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸米根霉菌株的筛选方法。
技术介绍
γ-氨基丁酸的别名为氨酪酸或哌啶酸，化学名为4-氨基丁酸，其分子式为NH2CH2CH2CH2COOH，分子量为103.1。γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。因此，γ-氨基丁酸成为重要的医药与保健原料。γ-氨基丁酸结构式为：目前，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法等。其中，化学合成方法成本高产率低，且在生产过程中涉及到有毒溶剂，存在化学试剂残留，因此安全方面存在隐患；植物富集法依赖于种植业，收到气候、地域等影响较大，产量不稳定，难以满足日益增长的需要。微生物合成法主要是利用微生物发酵，通过筛选优良、高产且稳定的微生物菌株，发酵生产γ-氨基丁酸，主要包括乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、谷氨酸棒状杆菌等。然而，目前通过微生物发酵生产γ-氨基丁酸的产量还较低，主要有以下几个原因：(1)微生物培养成本过高，培养基比较昂贵，发酵设备投资较大；(2)由于γ-氨基丁酸是水溶性，因而从发酵产物中提取γ-氨基丁酸的工艺比较复杂。因此需要筛选新的能够生产γ-氨基丁酸的菌株。米根霉是一种常见的霉菌，在自然界中分布十分广泛。米根霉在酿造中扮演着十分重要的角色，由于其能产生活性很强的淀粉酶，在酿酒工业上常用作淀粉质原料的糖化菌，我国最早利用根霉糖化淀粉(阿明诺法)生产酒精。米根霉在生长过程中能够产生苹果酸、γ-氨基丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸等多种有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料以及环境等领域。因此可以采用根霉来生产γ-氨基丁酸，用于食品与医药行业。本专利技术筛选到一株高产γ-氨基丁酸米根霉株，对该菌进行了鉴定，对生产γ-氨基丁酸的培养条件进行了初步研究，为微生物合成γ-氨基丁酸工业化提供了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株高产γ-氨基丁酸的米根霉，并对其进行了分类学鉴定，该菌命名为RhizopusoryzaeQ1。对发酵产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物合成γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。为实现上述目的，专利技术人首次分离纯化到一株能够产生γ-氨基丁酸的新菌株。经过18SrDNA和生理生化鉴定，该菌株为米根霉(Rhizopusoryzae)，命名为米根霉Q1(RhizopusoryzaeQ1)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏号为CCTCCM2016565。菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液。发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析。菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增末班，使用真菌18SrDNA的通用引物进行序列扩增，PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次。PCR体系组成：DNA模板0.2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTPs溶液5μL，DNA聚合酶0.2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，去离子水19.1μL。取PCR产物1μL，加5μLLoadingbuffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，DNAGreen染色后，在紫外灯下观察电泳条带。用凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18SrDNA的测序，将测序结果与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析。米根霉Q1为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养2-3天，至孢子成熟；采用无菌水洗下孢子，将孢子数稀释到107个/mL；以1-5％的体积比将孢子悬浮液转接至发酵培养基，在30℃条件下培养5天。产孢子培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。发酵培养基成分为：糯米30g，谷氨酸0-0.6g，水5-30g，自然pH，121℃下灭菌20分钟。本专利技术方法的优点：(1)米根霉生长周期较短，仅需要3-5天即可产生高浓度的γ-氨基丁酸，比目前已知的微生物菌种产量都高，这一过程决定了生产工艺将较短，并且不容易被其他微生物污染。(2)本专利技术中采用的米根霉，所需的发酵培养基组成比较简单，仅需要大米即可，不需要额外添加特殊的物质，因此在工业上应用比较便利。(3)米根霉生长能力较强，仅需要2天即可将菌丝体长满培养基，然后分泌出淀粉酶等分解培养基中的营养物质，能够快速并充分地利用培养基中的营养物质，只需要一般的发酵车间即可生产，易于推广。生物材料样品的保藏信息：保藏的生物材料样品：米根霉Q1(RhizopusoryzaeQ1)；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心(邮编：430072)；保藏日期：2016年10月17日；保藏登记号：CCTCCM2016565。附图说明图1是米根霉Q1孢子囊和假根的显微形态图。图2是γ-氨基丁酸与其他20种氨基酸标准物的氨基酸图谱，图中共有21个峰信号，由左向右依次为：牛磺酸(Tau)，天冬氨酸(Asp)，苏氨酸(Thr)，丝氨酸(Ser)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，缬氨酸(Val)，甲硫氨酸(Met)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，酪氨酸(Tyr)，苯丙氨酸(Phe)，γ-氨基丁酸(GABA)，鸟氨酸(Orn)，赖氨酸(Lys)，氨(NH3)，组氨酸(His)，色氨酸(Trp)，精氨酸(Arg)；21个信号峰的出峰时间依次为2.19分钟，4.95分钟，5.64分钟，6.21分钟，7.09分钟，10.17分钟，11.29分钟，12.60分钟，13.19分钟，14.45分钟，16.79分钟，17.99分钟，19.37分钟，20.57分钟，21.56分钟，22.39分钟，23.00分钟，23.85分钟，25.08分钟，28.17分钟，29.27分钟。图3是米根霉Q1发酵产物中γ-氨基丁酸的氨基酸图谱，图中出峰时间为21.56分钟的信号峰代表γ-氨基丁酸。具体实施方式实施例1：高产γ-氨基丁酸菌种的筛选本实施例在湖北地区的酒厂等处采集酒曲，进行米根霉Q1(RhizopusoryzaeQ1)的筛选。方法如下：米根霉的筛选：将采集的酒曲样品用无菌水稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，在30℃条件下培养2-3天后，根据菌落形态挑取生长出来的米根霉单菌落。在筛选培养基上反复多次划线培养，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株，其特征在于：其分类命名为米根霉(Rhizopus oryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2016565。

【技术特征摘要】
1.一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌株，其特征在于：其分类命名为米根霉(Rhizopusoryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2016565。2.根据权利要求1所述米根霉株Q1的筛选方法，其特征是：(1)菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；(2)γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液；发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析；(3)菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增模板，使用真菌18SrDNA的通用引物进行序列扩增，正向引物为P1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；反向引物为P2：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG；PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：李牧，陈福生，南小华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42