一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种三维荧光差分超分辨显微装置，包括激光器、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜；所述的激光器和显微物镜之间依次设有：用于将所述激光器发出的光束改变为线偏振光的起偏器；用于调制所述线偏振光偏振方向的第一二分之一波片；用于依次调制光束水平分量和垂直分量的空间光调制模块；用于对圆偏振光进行光路偏转的扫描振镜系统，由所述扫描振镜系统出射的圆偏振光经显微物镜投射到待测样品上；还包括采集待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制模块和扫描振镜系统的计算机。本发明专利技术还公开基于上述三维荧光差分超分辨显微装置实现的显微方法。

【技术实现步骤摘要】
一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置
本专利技术属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置。
技术介绍
1873年，德国科学家Abbe提出光学成像系统的“衍射极限”，任何光学显微镜都存在一个分辨率极限，由光波长以及透镜的数值孔径决定。光学显微成像系统由于“衍射极限”的存在，在可见光波段无法实现200纳米以下的高分辨成像。为此人们不断努力，研究发展超分辨成像技术，希望突破衍射极限，获得更高的分辨率。2014年从事荧光超分辨光学显微术的三位科学家获得了诺贝尔化学奖，他们开启了人类利用荧光标记方法实现超分辨显微的大门。从此，人类的光学显微已进入超分辨时代。现在主流超分辨显微成像技术可以大致分为两类：一类是基于经典共焦系统，如受激辐射淬灭显微术(STED)，荧光发射微分显微术(FED)；另一类是基于宽场成像系统，如随机光学重组显微术(STORM)、结构光照明显微术(SIM)、光子活化定位显微术(PALM)等等。近年来，超分辨技术得到了迅猛发展，其发展方向已经不在单单局限于横向分辨率的提高，而是向着提高三维分辨率、提高成像速度、系统集成化紧凑化发展。以上提到的超分辨显微术中，有的已经向三维方向发展，为医学或生物学研究人员提供更多的微观信息。随着分辨率的提升，光学超分辨显微方法和装置越来越受到医学和生物学领域研究人员的青睐。其快速直观无损的特定，使其得到了更多的应用，因此，高集成化、易使用，高分辨率的光学超分辨显微装置也成为了研究者们关注的重点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置，可以实现超越衍射极限的三维分辨率。系统结构紧凑，单激发光路，调校方便，该方法装置简单，成像速度快，对样品没有特殊荧光染料要求。可应用于生物、医学研究中对衍射极限一下微观结构细节的三维成像。本专利技术的具体技术方案如下：一种三维荧光差分超分辨显微装置，包括激光器、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜，所述激光器与显微物镜之间依次设有：用于将所述激光器发出的激光转换为平行光的准直器；用于将所述激光器发出的光束改变为线偏振光的起偏器；用于调制所述光束偏振方向的第一二分之一波片；用于依次调制光束水平分量和垂直分量的空间光调制模块；用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统；所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。优选的，所述的空间光调制模块包括：空间光调制器，由所述计算机控制加载黑色背景或同时加载0～π相位调制图案和0～2π涡旋相位调图案；反射镜，用于将空间光调制器反射的光束再次反射进入空间光调制器内；位于所述空间光调制器和反射镜之间的第一四分之一波片，用于将两次经过的光束的偏振方向转过90度。进一步优选的，所述的空间光调制模块和扫描振镜系统间设有用于将偏振光转换为圆偏振光的第二二分之一波片和第二四分之一波片。本专利技术中，探测系统包括：布置在第二四分之一波片和扫描振镜系统之间的分束镜。所述分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜。用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。所述激光器与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤。所述空间光调制器液晶屏幕在左右两侧同时加载0～π相位调制图案和0～2π涡旋相位调图案；空间光调制器中加载调制图案和黑色背景的切换频率与扫描振镜系统的空间扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统配合电动样品太每扫描一次三维空间，空间光调制器的调制函数切换一次。优选的，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.49。根据上述的三维荧光差分超分辨显微装置，本专利技术的显微方法包括以下步骤：1)激光器发出的激光光束在准直后转换为线偏振光；2)调节第一二分之一波片，使光束的偏振方向与空间光调制器可调节偏振方向成α角；3)将偏振光入射至空间光调制器的屏幕一侧，利用该侧加载的0～π相位调制图案对偏振光进行相位调制；4)控制空间光调制器反射后的光束重新折返入射至空间光调制器的屏幕另一侧，利用该侧加载的0～2π涡旋相位调图案进行相位调制；5)两次调制后的激光光束在转化为圆偏后经扫描振镜系统和显微物镜聚焦到样品上并进行扫描；6)在扫描过程中实时收集被测样品各被激发点发出的信号光，得到一次扫描信号光强I1(x,y,z)；7)将步骤3)和步骤4)内的空间光调制器上仅加载黑色背景，重复步骤3)～6)，对相同的三维空间进行第二次扫描，得到二次扫描信号光强I2(x,y,z)；8)根据公式I(x,y,z)＝I2(x,y,z)-r×I1(x,y,z)计算最终信号光强I(x,y,z)，并利用I(x,y,z)得到超分辨图像；其中r＝I2max/2×I1max，I2max为I2(x,y,z)的最大值，I1max为I1(x,y,z)中的最大值。本专利技术中，当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。其中，被测样品上x，y，z轴方向由三维扫描方式决定。作为优选的，最终信号光强I(x,y,z)为负值时，令I(x,y,z)＝0。本专利技术原理如下：根据经典衍射理论，实际光学系统对平行光的聚焦效果，并非理想的点，而是一个可计算其空间尺寸的梭形空间分布，长轴延光轴方向，在焦面上即衍射斑或艾里斑。艾里斑范围内的样品都会被激发从而发出信号光，使得在艾里斑范围内的样品细节无法被分辨。因此，显微系统的分辨率受到衍射极限的限制。所以，突破衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，减小艾里斑面积是关键。理论上艾里斑是无法通过光学器件减小的，但是可以通过其他手段减小系统最终的等效激发面积，从而达到提高分辨率的目的。同理对于三维超分辨而言，提高显微镜分辨率，减小空间聚焦光斑的体积是关键。在本专利技术方法中，空间光调制器左侧加载0～π相位调制图案右侧加载0～2π涡旋相位调制图案。当光束被0～π相位调制后，根据矢量光场衍射理论，由狄拜积分计算可知，此时光束经显微物镜聚焦后的光场，在焦面空间附近为一强度极弱的空心圆柱，圆柱两端为强度较强的细实心圆柱。。当光束被0～2π涡旋相位调制后，同理可计算得到，此时光束经显微镜物镜聚焦后在焦面空间附近为一个空心圆柱分布，在焦面上为一个甜甜圈形空心光斑光束首先入射到空间光调制器的左侧，此时空间光调制器左侧加载的0～π相位图案只对光束水平方向的分量进行调制，垂直分量未被调制。当光束经偏振旋转90度后，再次入射到空间光调制器上左侧时，之前的水平分量变为垂直分量，其不会被再次调制，之前的垂直分量变为水平分量，被空间光调制器右侧加载的0～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三维荧光差分超分辨显微装置，包括激光器、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜，其特征在于：所述的激光器和显微物镜之间依次设有：用于将所述激光器发出的光束改变为线偏振光的起偏器；用于调制所述线偏振光偏振方向的第一二分之一波片；用于依次调制光束水平分量和垂直分量的空间光调制模块；用于对圆偏振光进行光路偏转的扫描振镜系统，由所述扫描振镜系统出射的圆偏振光经显微物镜投射到待测样品上；还包括采集待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制模块和扫描振镜系统的计算机。

【技术特征摘要】
1.一种三维荧光差分超分辨显微装置，包括激光器、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜，其特征在于：所述的激光器和显微物镜之间依次设有：用于将所述激光器发出的光束改变为线偏振光的起偏器；用于调制所述线偏振光偏振方向的第一二分之一波片；用于依次调制光束水平分量和垂直分量的空间光调制模块；用于对圆偏振光进行光路偏转的扫描振镜系统，由所述扫描振镜系统出射的圆偏振光经显微物镜投射到待测样品上；还包括采集待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制模块和扫描振镜系统的计算机。2.如权利要求1所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：所述的空间光调制模块包括：空间光调制器，由所述计算机控制加载黑色背景或同时加载0～π相位调制图案和0～2π涡旋相位调图案；反射镜，用于将空间光调制器反射的光束再次反射进入空间光调制器内；位于所述空间光调制器和反射镜之间的第一四分之一波片，用于将两次经过的光束的偏振方向转过90度。3.如权利要求1所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：所述的空间光调制模块和扫描振镜系统间设有用于将偏振光转换为圆偏振光的第二二分之一波片和第二四分之一波片。4.如权利要求3所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：由所述第一二分之一波片出射的光束经一D形反射镜后入射至空间光调制模块。5.如权利要求1所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：所述的探测系统包括：布置在第二四分之一波片和扫描振镜系统间的分束镜，用于探测信号光束的光强信号的探测器，用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜，和用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器。6.一种基于权利要求1～5任一项所述三维荧光差分超分辨显微装置实现的显微方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，朱大钊，陈友华，刘文杰，匡翠方，张克奇，毛磊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33