巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法技术

本发明专利技术提供一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法，涉及生物检测技术领域。一种巯基类化合物的检测方法，包括：向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液，检测检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰，荧光探针分子由2,4‑二硝基苯磺酰氯和荧光母体反应而成。该检测方法可快速、高效的检测巯基类化合物，专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强，对巯基类化合物具有很好的荧光响应。一种荧光成像方法，将上述荧光探针分子结合到待成像物，使巯基类化合物与荧光探针分子反应以使待成像物产生荧光，利用成像仪检测待成像物产生的荧光。该方法检测荧光效果明显，操作简便，在细胞成像应用中具有良好的效果。

【技术实现步骤摘要】
巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法
本专利技术涉及生物检测
，且特别涉及一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法。
技术介绍
巯基类化合物在(如半胱氨酸，谷胱甘肽和高半胱氨酸等)生物体内的许多生理过程中发挥着重要作用，例如维持生物体内氧化还原的动态平衡、影响体内生物酶活性等，而且多种疾病的发病机制也与生物体内的巯基化合物水平密切相关。巯基类物质的变化，在人体生命现象中主要表现为：半胱氨酸的缺乏会导致生长缓慢、头发变白、脑水肿、肝损伤、嗜眠症、皮肤病变、身体虚弱等；细胞内高半胱氨酸的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默有直接关联；作为三肽化合物的谷胱甘肽，是哺乳动物组织中含量最丰富的细胞内小分子生物巯基化合物之一，在维持生物体还原性内环境方面发挥着重要作用；作为一种抗氧化剂，还原型的谷胱甘肽可以有效阻止自由基或过氧化物对细胞内重要组成部分的损伤，并且与氧化型的谷胱甘肽的比例也是监测细胞内氧化水平的重要参数指标。因此，巯基化合物的检测对于人体健康和疾病诊断具有重要的意义。目前，巯基类化合物检测的方法主要有：酶促法、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)、结合电化学检测的毛细管电泳法、荧光分析与比色法等。上述方法各具优势，但是作为快速检测方法，会明显暴露出缺点，例如，酶促实验过程复杂，不适宜用于日常分析。HPLC的特异性好，但是仪器依赖度高，价格昂贵，耗时较长，可用于能检测生物巯基的总量，但灵敏度不高，对样品的需求量较大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种巯基类化合物的检测方法，以制备的荧光检测物质作为探针，可快速、高效的检测巯基类化合物，专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强，对巯基类化合物具有很好的荧光响应。本专利技术的另一目的在于提供一种荧光成像方法，将上述荧光探针分子结合到待成像物，检测荧光。该方法检测荧光效果明显，操作简便，在细胞成像应用中具有良好的效果。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术提出一种巯基类化合物的检测方法，包括：向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液，检测检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰，荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成；其中，R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种，R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种，R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个；如果存在荧光、特征峰中的一种或两种，则待检测物中存在巯基类化合物；如果不存在荧光和特征峰，则待检测物中不存在巯基类化合物。本专利技术还提供了一种荧光成像方法，将上述荧光探针分子结合到待成像物，使巯基类化合物与荧光探针分子反应以使待成像物产生荧光，利用成像仪检测待成像物产生的荧光；荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成；其中，R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种，R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种，R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。本专利技术实施例的一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法的有益效果是：本专利技术以制备的荧光探针分子配制荧光探针溶液，向荧光探针溶液中加入待检测物质进行荧光检测。荧光探针分子中的苯磺酸酯键与半胱氨酸分子结构中的巯基发生专一性化学反应后，由于影响激发态分子内质子转移(excited-stateintramolecularprotontransfer，ESIPT)过程的羟基官能团的2,4-二硝基苯磺酸基从母体分子脱离，荧光母体的荧光性质恢复，出现特征发射峰。该检测方法可快速、高效的检测巯基类化合物，专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强，对巯基类化合物具有很好的荧光响应。一种荧光成像方法，将上述荧光探针分子结合到待成像物，检测荧光。该方法检测荧光效果明显，操作简便，在细胞成像应用中具有良好的效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例4的荧光探针在两组细胞内的透射电镜图；图2为本专利技术实施例8的荧光探针溶液与不同浓度的半胱氨酸的荧光光谱图；图3为本专利技术实施例8的荧光探针溶液与相同浓度的半胱氨酸及不同物质混合物的荧光光谱图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法进行具体说明。本专利技术实施例提供的一种巯基类化合物的检测方法，包括：步骤S101：由如式(I)所示的荧光母体与2,4-二硝基苯磺酰氯反应制备荧光探针分子。其中，R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种，R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种，R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。在本专利技术的实施例中，具体地，荧光母体为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑，其可以通过购买直接获得，也可通过实验制备获得。具体地，荧光母体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的制备方法包括：将水杨醛溶于一定量的乙醇溶剂中，加入亚硫酸氢钠后，为了溶解的充分，磁力搅拌1.5～2.5h；再加入溶有邻苯二胺的乙醇溶剂，升温加热至回流后，继续反应3～5h；反应结束后，将反应产物置于冰水浴中，静置3～5h待无固体继续析出后，过滤得固体，该固体为粗产品；为了得到纯物质，将过滤后的固体真空干燥，以体积比为1:4～6的乙酸乙酯和石油醚作为淋洗剂，进行柱层析提纯，产物即为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。其中，水杨醛、乙醇、亚硫酸氢钠、邻苯二胺的用量比为1mmol:15～35ml:1～1.5mmol:1～1.5mmol。在本专利技术实施例中，作为荧光母体的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑与2,4-二硝基苯磺酰氯的反应包括：在冰水浴中，将荧光母体充分溶于二氯甲烷溶剂中，加入缚酸剂三乙胺；在本专利技术的实施例中，溶剂也可以选用其他有机试剂，如乙醇等；为了让反应更加充分，在磁力搅拌的条件下，逐滴滴加溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷；在冰水浴中反应18～24h，反应结束后，通过减压蒸馏得粗产品，再通过柱层析提纯产物。提纯过程中，以乙酸乙酯和石油醚的混合液作为淋洗剂，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2～4。较优的，在本专利技术实施例中，冰水浴的温度为-10～0℃。其中，荧光母体、溶剂、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比为1mmol:30～50ml:1～2mmol:1～2mmol。该范围值是专利技术人经过创造性劳动并结合自身经验得到的优选值。步骤S102：制得荧光探针分子后，配制荧光探针溶液。在本专利技术实施例中，荧光探针溶液由荧光探针分子及荧光探针溶剂混合而成。具体地，荧光探针溶剂由体积比为1:1～2的乙腈和含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液混合而成。其中，含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巯基类化合物的检测方法，其特征在于，包括：向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液，检测所述检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰，所述荧光探针分子由2,4‑二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的所述荧光母体反应而成；

【技术特征摘要】
1.一种巯基类化合物的检测方法，其特征在于，包括：向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液，检测所述检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰，所述荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的所述荧光母体反应而成；其中，R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种，R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种，R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个；如果存在所述荧光、所述特征峰中的一种或两种，则所述待检测物中存在所述巯基类化合物；如果不存在所述荧光和所述特征峰，则所述待检测物中不存在所述巯基类化合物。2.根据权利要求1所述的巯基类化合物的检测方法，其特征在于，所述荧光母体为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。3.根据权利要求1所述的巯基类化合物的检测方法，其特征在于，所述荧光探针溶液的溶剂由体积比为1:1～2的乙腈和含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液混合而成。4.根据权利要求3所述的巯基类化合物的检测方法，其特征在于，所述缓冲液中所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为15～35mmol/L。5.根据权利要求3或4所述的巯基类化合物的检测方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7～7.5。6.根据权利要求2所述的巯基类化合物的检测方法，其特征在于，所述2-(2-羟基苯基)苯并咪唑与所述2,4-二硝基苯磺酰氯反应的方法包括：向溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑鹭飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11