一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法，所示方法包括以下步骤：1)细胞培养，2)细胞染毒，3)γH2AX的免疫荧光标记，4)高内涵技术定量分析。本发明专利技术的优点在于：利用高内涵成像系统自动成像，定量分析焦油诱导产生的DNA双链断裂标志物γH2AX蛋白质，实现了细胞的直接、快速检测，使得样本处理更为方便；高分辨率的成像，不仅使γH2AX在细胞核内的分布可直接观测而且使图像资料便于存储和再分析，并且可以实现对焦油在每个细胞核内诱导的γH2AX进行定量分析，检测结果更为灵敏和准确。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法
本专利技术属于DNA损伤体外检测
，更具体而言，本专利技术涉及焦油致细胞DNA损伤的体外定量分析方法。
技术介绍
卷烟烟气可按照物质的状态分成两相，一种为气相，一种为粒相，粒相物质即为焦油。卷烟焦油中含有多种有毒物质，如超氧阴离子O·-，过氧化氢等活性氧类物质，醛类，苯并芘等。焦油可以诱发多种癌症和呼吸道疾病，其中的活性自由基和有毒物质可以诱导DNA产生氧化性损伤、DNA链断裂、微核、基因突变等。所以，准确检测焦油对细胞DNA的损伤对于焦油的遗传毒性和危害性评价具有重要的意义。DNA双链断裂是DNA最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为DNA双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γH2AX已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γH2AX实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，Tanaka等利用γH2AX实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；Smart等采用γH2AX实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的DNA双链断裂的剂量-效应关系进行了研究。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。目前对γH2AX进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、ELISA(酶联免疫吸附试验)、WesternBlot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和WesternBlot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。ELISA不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的焦油致DNA损伤的定量分析方法，该方法的检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。本专利技术的目的通过将高内涵技术和γH2AX的定量分析相结合而实现。具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含焦油和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。优选地，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；更优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO2条件下培养24h。优选地，所述步骤2)中，所述焦油通过以下方法制备：标准卷烟样品于温度(22±1)℃和相对湿度60％±3％下平衡48-72后，抽吸该卷烟样品，收集总粒相物，然后加入DMSO(二甲基亚砜)配制成浓度为8-100mg/mL的烟气粒相物溶液(焦油)，-80℃下保存备用。根据本专利技术的具体实施方式，所述标准卷烟样品为3R4F。优选地，所述细胞染毒液中焦油的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为3.91-500μg/mL；根据本专利技术的具体实施方式，所述细胞染毒液中焦油的浓度可以是0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250或500μg/mL。优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。优选地，所述步骤3)包括：3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；3-2)洗涤细胞，然后加入Triton-100X以使细胞通透；3-3)洗涤细胞，然后加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；3-4)洗涤细胞，然后加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；3-5)洗涤细胞，加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行染色；3-6)洗涤细胞，保存。优选地，所述步骤4)中，所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定分别在两组不同的激发波长和发射波长下进行；优选地，所述步骤3-4)中，免疫荧光标记的二抗为AlexaFluor488标记的二抗，并且所述步骤4)中，在通道一中以激发波长358nm和发射波长461nm进行细胞核的荧光测定，在通道二中以激发波长495nm和发射波长519nm进行γH2AX的荧光测定，以获得通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度，由此表征γH2AX的含量；更优选地，在两个通道中，测量倍数为200倍，每孔分析和测定9个视野。根据本专利技术的具体实施方式，步骤4)采用高内涵细胞分析系统进行，例如购自ThermoScientific的型号为ArrayScanVTI600的高内涵细胞分析系统。任选地，本专利技术的方法还包括，设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，从而在步骤4)中得到由非特异吸附引起的空白信号，由此从检测到的荧光测定信号中扣除空白信号。本专利技术的方法还可包括剂量-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中设置多种包含不同浓度的焦油的细胞染毒液，进行所述方法，最后根据γH2AX的平均荧光强度和焦油的浓度绘制剂量-效应曲线。或者，本专利技术的方法还可包括时间-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中将细胞在包含相同浓度的焦油的细胞染毒液中培养不同时间，进行所述方法，最后根据γH2AX的平均荧光强度和培养时间绘制时间-效应曲线。根据本专利技术的具体实施方式，当细胞为人肺癌细胞株A549时，可以如下进行本专利技术的方法：1)细胞培养：采用含10％FBS和2mmoL/LL-谷氨酰胺的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2条件下在培养箱中培养人肺癌细胞株A549，当细胞汇合率达到70-80％时，采用0.25％的胰蛋白酶进行消化后获得单细胞悬液，然后以每孔100μL浓度为105个细胞/mL的接种量接种于96孔细胞培养板，在含10％FBS和2mmoL/LL-谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中于37℃，5％CO2条件下培养24h。2)细胞染毒：吸弃培养24h后的细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液为分别包含0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250及500μg/mL焦油的步骤1)中的细胞培养液。浓度组至少设置两组空白对照，空白对照组仅添加含10％FBS和2mmoL/LL-谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，于37℃，5％CO2的条件下培养24h。3)免疫荧光标记：3-1)吸弃细胞染毒液，每孔加入100μLPBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2～7.4；全文同)洗涤细胞两次，每次至少5min；然后每孔加入50μL4％的多聚甲醛溶液在室温下固定15min；3-2)固定好的细胞再用PBS洗涤两次，每次至少5min；然后加入50μL0.5％的Triton本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含焦油和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

【技术特征摘要】
1.一种基于高内涵技术定量分析焦油致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含焦油和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO2条件下培养24h。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述焦油通过以下方法制备：标准卷烟样品于温度(22±1)℃和相对湿度60％±3％下平衡48-72h后，抽吸该卷烟样品，收集总粒相物，然后加入DMSO(二甲基亚砜)配制成浓度为8-100mg/mL的烟气粒相物溶液(焦油)，-80℃下保存备用。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述细胞染毒液中焦油的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为3.91-500μg/mL；优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；3-2)洗涤细胞，然后加入Triton-100...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯宏卫，张森，胡清源，陈欢，王安，刘勇，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41