一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法，具体涉及超声波辅助固态发酵菜籽饼粕制备低聚肽技术，属于发酵工程技术领域；本发明专利技术所述方法在微生物发酵稳定期后期，利用高强度聚能式超声来处理固态发酵后的菜籽饼粕悬浮液制备低聚肽的方法；该方法能有效将超声作用于固态发酵产物，破坏细胞壁的结构，将大量的胞内蛋白酶释放并溶解于液体中，极大地促进了发酵物的酶解，有效避免了微生物将酶解产物转化为胞内蛋白，从而进一步提高了固态发酵生产低聚肽的效率。

Method for improving yield of oligopeptide produced by solid state fermentation

The invention relates to a preparation method of solid state fermentation to improve the yield of oligopeptides, which relates to ultrasonic assisted solid-state fermentation of rapeseed meal preparation of oligopeptides, which belongs to the technical field of fermentation engineering; the method of the invention in the microbial fermentation of the stationary phase, the use of high strength poly type ultrasonic processing of rapeseed meal suspension system after the solid-state fermentation preparation method of oligopeptides; this method can effectively be ultrasonic in solid state fermentation products, destroy the structure of cell wall, a large number of intracellular proteases released and dissolved in a liquid, greatly promoted the fermentation enzyme, can effectively avoid the microbial enzymatic product into intracellular protein and it further improves the efficiency of oligopeptide production by solid-state fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法
本专利技术涉及一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法，具体涉及超声波辅助固态发酵菜籽饼粕制备低聚肽技术，属于发酵工程

技术介绍
固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。固态发酵具有以下优点：（1）水分活度低，基质水不溶性高，微生物易生长，酶活力高，酶系丰富；（2）发酵过程粗放，不需严格无菌条件；（3）设备构造简单、投资少、能耗低、易操作；（4）后处理简便、污染少，基本无废水排放。菜籽饼粕，是生产菜籽油剩下的副产物。我国的菜籽饼粕资源丰富，年产量700万吨以上。菜籽饼粕氨基酸组成较平衡，含有多种矿物质，其蛋白含量高达35%~45%，营养价值非常丰富。但是菜籽饼粕中同时也有较多硫甙、单宁、植酸等抗营养因子，导致其营养物质利用率低，目前仅少量应用于动物饲料领域，大部分直接用作肥料处理，造成资源的浪费。目前大多采用传统的微生物固态发酵法降解菜籽饼粕的抗营养因子，该方法不仅工艺简单，脱毒彻底，而且能进一步提高其蛋白和多肽含量。但是利用固态发酵制备低聚肽仍存在发酵速度慢，低聚肽含量低等问题，从而限制了其大规模生产。固态发酵过程中，在对数生长期，细胞会分泌出大量的蛋白酶酶解菜籽饼粕，但是该蛋白酶酶解好的多肽和氨基酸马上会被细胞吸收利用。在细胞稳定生长期，细胞内残留有大量的蛋白酶。聚能式超声能对细胞壁产生很好的破坏作用，能释放大量的胞内蛋白和蛋白酶，可以进一步产生多肽。且超声具有很好的传质传热效果，可以强化酶解效果。但是超声波需要在液体环境中才能产生空化作用，如何将超声应用于该发酵体系是解决上述问题的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种促进固态发酵菜籽饼粕制备低聚肽的方法，具体是将固态发酵后的菜籽饼粕加入一定体积的水制成悬浮液，超声处理破壁细胞，使得胞内蛋白酶释放，蛋白酶作用于培养基蛋白和细菌蛋白，最终实现酶解产物中的多肽产量大幅提升。为了实现上述专利技术目的，其具体的技术方案如下：（1）制备发酵种子液，接种菜籽粕固态培养基，进行固态发酵。（2）固态发酵稳定生长期后期时，在该固态发酵瓶中加入一定体积的水，搅拌均匀后制成悬浮液。然后施加聚能式超声处理（功率500~800W、总时间10~30min，处理体积为100~200mL）。超声处理后将培养基在45~55℃温度恒温4~6h。本专利技术与现有技术相比较，存在的技术优点：固态发酵菜籽饼粕进入稳定期后期，采用聚能式超声处理其悬浮液，一方面，超声的传质传热，有助于胞外蛋白酶、菜籽蛋白质的溶解，强化培养基中的蛋白质的酶解；另一方面，高强度聚能式超声能够有效破坏细胞壁结构，成功释放胞内蛋白酶和细菌胞内蛋白，细菌胞内蛋白质在蛋白酶的作用下进一步生成多肽，最终使得低聚肽生产效率大幅提高，本专利技术中培养基中多肽含量相比于未超声处理最高提高了93.7%，相比于固态发酵细菌生长对数期和稳定期中期施加超声处理，多肽产量显著提升，分别最多提高了4.5倍和1.8倍。具体实施方式下面通过实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是，对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述专利技术的内容对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。对照和实施例中所用的多肽含量测定的方法如下：采用双缩脉测蛋白法，具体操作步骤如下：称取2.0g样品，加入20mL水，混合均匀，50℃水浴0.5h，取5mL上清液于一试管中，加入5mL10%三氯乙酸溶液，静置沉降20min后转到离心管中，在8000r/min下离心15min，取上清液2mL并转到另一试管中，再加入4mL双缩脲试剂，显色30min，用分光光度计在540nm处比色。实施例中采用的超声设备为超声波细胞破碎仪（无锡上佳生物科技有限公司）。对照例和实施例所述的菌液不限于枯草芽孢杆菌和白地霉，还包括一些产蛋白酶的其他菌，例如地衣芽孢杆菌，曲霉菌和毛霉菌，所涉及菌种均为市场购买所得。对照例1：（1）培养基的配制4%尿素，10%的麸皮，40%的菜籽粕，50%水分，200mL三角瓶装量为20g，121℃灭菌25min。（2）固态发酵菌种活化将枯草芽孢杆菌和白地霉的菌种从斜面培养基分别接种到装有100mLLB和装有100mL麦芽汁液体种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃，200r/min摇床中培养48h后转移到冰箱中备用。（3）固态发酵将枯草芽孢杆菌和白地霉活化菌种同时投入装有200mL菜籽粕发酵培养基的三角瓶中，总接种量为10%，其中枯草芽孢杆菌和白地霉各1/2。发酵温度为30℃，发酵时间为48h。多肽含量测定为112.7mg/g。对照例2：（1）培养基的配制同对照例1步骤1。（2）固态发酵菌种活化同对照例1步骤2。（3）固态发酵将枯草芽孢杆菌和白地霉活化菌种同时投入装有200mL菜籽粕发酵培养基的三角瓶中，总接种量为10%，其中枯草芽孢杆菌和白地霉各1/2。发酵温度为30℃，发酵时间为10h（生长对数期）。（4）超声处理生长对数期发酵物取发酵物，加入100mL水，搅拌均匀，进行聚能式超声处理（超声参数：功率500W、总时间15min）。超声处理后将培养基在45℃温度恒温4h，培养基中多肽含量测定为39.8mg/g。对照例3：（1）培养基的配制同对照例1步骤1。（2）固态发酵菌种活化同对照例1步骤2。（3）固态发酵将枯草芽孢杆菌和白地霉活化菌种同时投入装有200mL菜籽粕发酵培养基的三角瓶中，总接种量为10%，其中枯草芽孢杆菌和白地霉各1/2。发酵温度为30℃，发酵时间为18h（稳定期中期）。（4）超声处理稳定期中期发酵物取发酵物，加入100mL水，搅拌均匀，进行聚能式超声处理（超声参数：功率500W、总时间15min）。超声处理后将培养基在45℃温度恒温4h，培养基中多肽含量测定为76.6mg/g。实施例1：（1）培养基的配制同对照例1步骤1。（2）固态发酵菌种活化同对照例1步骤2。（3）固态发酵将枯草芽孢杆菌和白地霉活化菌种同时投入装有200mL菜籽粕发酵培养基的三角瓶中，总接种量为10%，其中枯草芽孢杆菌和白地霉各1/2。发酵温度为30℃，发酵时间为22h（稳定期后期）。（4）超声处理稳定期后期发酵物取发酵物，加入100mL水，搅拌均匀，进行聚能式超声处理（超声参数：功率500W、总时间15min）。超声处理后将培养基在45℃温度恒温4h，培养基中多肽含量测定为195.1mg/g。实施例2：（1）培养基的配制同对照例1步骤1。（2）固态发酵菌种活化同对照例1步骤2。（3）固态发酵同对实施1步骤3。（4）超声处理稳定期后期发酵物取发酵物，加入100mL水，搅拌均匀，进行聚能式超声处理（超声参数：功率600W、总时间1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法，其特征在于：在微生物固体发酵稳定期后期，采用聚能式超声处理固态发酵后的悬浮液，再进行恒温保温处理。

【技术特征摘要】
1.一种提高固态发酵制备低聚肽产量的方法，其特征在于：在微生物固体发酵稳定期后期，采用聚能式超声处理固态发酵后的悬浮液，再进行恒温保温处理。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚能式超声处理功率500~800W。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚能式超声处理时间10~30min...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄姗芬，马海乐，李云亮，王蓓，阮思煜，杨雪，王禹程，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32