外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列的特异性引物，以及包含该引物的检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒，以及检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法，以及特异性引物和试剂盒在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。本发明专利技术中引物组在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带；检测过程简捷，只需经过PCR扩增再测序即可，检测特异性强、灵敏度高，结果准确。

Primer set, reagent kit and detection method for detecting mutation of TNF coding region of outer protein A gene

The present invention provides specific primers for detecting different protein A gene TNF encoding nucleic acid sequence, and mutation detection including the primer of A gene encoding TNF protein of the outer area of the kit, and method for mutation detection of different protein A gene TNF encoding region, and the application of mutation specific primer and reagent in the detection of abnormal box protein A gene TNF encoding region of. Primer pairs amplified in suitable conditions in a single band in the invention, no non-specific band; simple detection process, only through PCR amplification and sequencing to detect strong specificity, high sensitivity, accurate results.

【技术实现步骤摘要】
外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒，以及试剂盒的应用。
技术介绍
先天性牙发育不全是一种牙齿发育缺陷的遗传性疾病，通常在牙胚形成中恒牙未能发育和形成。它分为非综合征型缺牙(non-syndromichypodontia，NSH，OMIM号为313500)和综合征型缺牙(syndromichypodontia，SH，OMIM号为305100)，前者表现为单纯缺牙，后者缺牙并伴随毛发稀少、汗腺少等。先天性牙发育不全会严重影响患者的咀嚼、发音、颜面美观、身心发育及心理健康。外异蛋白A(ectodysplasin-A，EDA)基因的突变是导致非综合征型缺牙和综合征型缺牙的决定性因素，EDA基因(NM_001399)位于X染色体的长臂上(Xq12-13.1)，有9个外显子，基因大小为425kb，经过拼接产生不同的构型，最长可编码391个氨基酸，称为EDA-A1，属于伴X隐性遗传。EDA蛋白形成三聚体，被弗林蛋白酶(furin)酶切之后分泌到细胞外，与三聚体膜蛋白EDA受体(EDAreceptor，EDAR)一对一结合，激活下游相关信号如NFκB等，影响外胚层发育。其中，编码TNF结构域的核酸序列如SEQIDNo.1所示，由外显子7、8、9组成，TNF结构域可以与EDA受体(EDAreceptor,EDAR)相互作用。EDA基因TNF编码区的突变会引起EDA蛋白结构变化，进而影响与EDAR相互作用及EDAR下游信号分子的激活，造成不同程度外胚层发育不全。通过在不同数据库，包括HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、Uniport(http://www.uniprot.org)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索EDA、OMIM号313500及305100等统计发现，到目前为止，已报道导致先天性非综合征型缺牙和综合征型缺牙的EDA基因突变已超过200例，突变位点分布于EDA蛋白的各个结构域，但大部分突变位点集中在TNF编码区，在导致氨基酸残基发生改变但没有改变开放阅读框ORF长度的100例错义突变中，共有64例突变发生在TNF编码区，且TNF结构域的不同的位点的突变可以导致不同的缺牙表型，如表1所列出，均为已报道的、可导致缺牙表型的突变。通过Naccess软件(http://www.bioinf.manchester.ac.uk/naccess/)计算TNF结构域氨基酸的相对溶剂可及性(relativesolventaccessibility，RSA)的值发现，导致非综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均RSA值绝大多数大于8，而导致综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均RSA值绝大多数小于8。因此，当TNF结构域的氨基酸位点侧链平均RSA值大于8时，突变导致的缺牙表型倾向于非综合型缺牙；而当TNF结构域的氨基酸位点侧链平均RSA值小于8时，突变导致的缺牙表型倾向于综合型缺牙。通过对EDA蛋白TNF结构域所有氨基酸位点进行侧链平均RSA值计算并预测其可能导致的缺牙表型得到表2。目前还没有一种检测人群样本的外异蛋白A基因TNF编码区突变、并根据基因突变判断表型的方法，因此建立检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法及检测和预测突变可能导致的表型迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列的特异性引物，以及包含该引物的检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒，以及检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法，以及特异性引物和试剂盒在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。本专利技术提供了三对特异性引物用于扩增外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列，通过将扩增得到的外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列与该基因的序列进行比对，判断外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列是否发生突变，并判断该基因突变可能引发的牙发育表型改变；并进一步根据计算氨基酸残基的侧链平均RSA值，判断综合征缺牙或者非综合征缺牙表型。本专利技术结果准确可靠、特异性强、灵敏度高、意义重大。为了实现上述目的，按照本
技术实现思路
的一个方面，提供了一种用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的引物组，该基因外显子7的引物碱基序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列；该基因外显子8的引物碱基序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的序列；该基因外显子9的引物碱基序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的序列。按照本
技术实现思路
的另一个方面，提供了一种包含所述引物用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒。优选地，试剂盒还包括利用引物组中的引物进行PCR反应的试剂；提取基因组DNA的试剂；阳性对照；阴性对照。优选地，PCR反应的试剂包括引物、TaqDNA聚合酶、dNTP；阳性对照为连接有EDA基因7号外显子的T载体即T-7质粒、连接有EDA基因8号外显子的T载体即T-8质粒、接有EDA基因9号外显子的T载体即T-9质粒，阴性对照为空白T载体。按照本
技术实现思路
的另一个方面，提供了一种用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法，所述方法包括以SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6为引物进行目的基因扩增的步骤。优选地，所述目的基因扩增以外异蛋白A基因TNF编码区外显子7、外显子8、外显子9的核酸序列为靶序列。外异蛋白A基因的GenBank登录号为NM_001399。按照本
技术实现思路
的另一个方面，所述的引物组在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。按照本
技术实现思路
的另一个方面，所述的试剂盒在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。本专利技术首次开发一种简捷、操作简便的检测方法及检测试剂盒，包括引物组和试剂组、检测方法以及缺牙表型判断方法，其中引物组涉及到EDA基因的TNF编码区，能快速获取该关键区域的核苷酸序列情况，明确突变位点，并根据突变位点检索、预测突变导致的表型。该方法的有益效果是：(1)建立了PCR体系，可扩增并检测人EDA基因7、8、9号外显子是否发生突变；(2)引物组在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带；(3)样本检测范围广，多种来源的基因组DNA样本，如人外周血、人体培养细胞、人体组织细胞、人口腔拭子等提取而得的基因组DNA；(4)操作简便，检测廉价；(5)检测过程简捷，只需经过PCR扩增再测序即可，检测特异性强、灵敏度高，结果准确；(6)建立了判断方法，来预测突变可能导致的缺牙表型。附图说明图1是EDA基因7、8、9号外显子PCR扩增产物阳性对照电泳图；图2是待测样本a外显子7核酸序列与SEQIDNo.7序列比对；图3是待测样本a外显子8核酸序列与SEQIDNo.8序列比对；图4是待测样本a外显子9核酸序列与SEQIDNo.9序列比对；图5是待测样本b外显子7核酸序列与SEQIDNo.7序列比对；图6是待测样本b外显子8核酸序列与SEQIDNo.8序列比对；图7是待测样本b外显子9核酸序列与SEQIDNo.9序列比对；图8是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的引物组，其特征在于，该基因外显子7的引物碱基序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；该基因外显子8的引物碱基序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列；该基因外显子9的引物碱基序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的引物组，其特征在于，该基因外显子7的引物碱基序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列；该基因外显子8的引物碱基序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的序列；该基因外显子9的引物碱基序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的序列。2.一种用于检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的三对引物组。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括利用引物组中的引物进行PCR反应的试剂；阳性对照；阴性对照。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的利用引物组中的引物进行PCR反应的试剂包括引物组、TaqDNA聚合酶和寡聚核苷酸；阳性对照为分别连接有EDA基因7号外显子、8号外显子、9号外显子的质粒(T-7质粒、T-8质粒、T-9质粒)...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏莉，翁俊，胡巧丽，杨艳，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42