一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种获得鳙性别特异遗传标记及其筛选方法和应用。筛选步骤包括：首先使用2b‑RAD技术对5雌5雄鳙鱼进行简化基因组测序，从中鉴定雄性特异序列。然后对其中一尾雄鳙进行基因组重测序与基因组组装，将雄鳙2b‑RAD特异序列在雄鳙基因组中进行比对搜索，获得长片断的雄鳙特异序列，并进行雄性特异引物设计。本发明专利技术首次筛选到鳙雄性特异序列及性别特异引物，建立了用于遗传性别鉴定的PCR技术。本方法具有成本低、操作简单、快速、准确等优点，为鳙性别标记开发及性别鉴定提供了可靠的技术手段。本方法也可以在其他鱼类性别标记开发及性别决定研究中进行推广应用。

A bighead carp sex specific markers and screening method and application thereof

The invention discloses a gender specific genetic marker for bighead carp and screening method and application thereof. The screening method comprises the following steps: first use the 2B RAD in 5 females and 5 males bighead to simplify genome sequencing, sequences identified from male specific. Then the one male of bighead carp genome sequencing and genome assembly, male 2B bighead carp RAD specific sequences in the male genome than in search of bighead carp, bighead carp have male specific sequence of long fragments, and male specific primer design. The present invention first screened bighead carp male specific sequence and gender specific primers for genetic sex identification of PCR is established. This method has the advantages of low cost, simple operation, rapid and accurate, provides a reliable means for marker development and sex identification sex of Bighead carp. This method can also be used in the development of sex markers and sex determination in other fish species.

【技术实现步骤摘要】
一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用
本专利技术隶属于生物
，涉及鱼类性别特异分子标记、及其筛选方法和应用。
技术介绍
在脊椎动物中，鱼类进化出了最多样化的性别决定机制。在一些鱼类中，性别是由遗传因素决定的，即它们在孵化的时候就有了确定的性别；但是另一些鱼类的性别却很大程度受环境的影响，如温度、pH、盐度等外界环境条件；鱼类最终的性别是遗传、环境及二者互作的结果(Devlinetal.Sexdeterminationandsexdifferentiationinfish:anoverviewofgenetic,physiological,andenvironmentalinfluences.Aquacμlture,2002,208(3):191-364.)。遗传因素性别决定的鱼类主要被分为两种类型，即XX/XY型和ZW/ZZ型。第一种类型的鱼雄性含有性别决定区域或性染色体，而第二种类型的鱼，性别决定区域或性染色则位于雌性鱼的基因组中。确定一个物种的性别决定机制，通常通过以下三种方法：a.从细胞遗传学的核型分析中寻找性别染色体；b.在实验室中培育性反转个体；c.发掘性别特异的分子标记(Gambleetal.Identificationofsex‐specificmolecμlarmarkersusingrestrictionsite‐associatedDNAsequencing[J].Molecμlarecologyresources,2014,14(5):902-913.)。前两种方法在鱼类性别鉴定中都有较大难度，例如大多数鱼类还没有形成像哺乳类动物那样的可以从视觉上区别的性别染色体；而且很多鱼类由于繁殖周期和养殖条件等原因在实验室条件下较难培育性反转群体，这就使得开发性别特异分子标记成为最有前途的研究鱼类性别机制的方法。鳙(Hypophthalmichthysnobilis)是我国四大家鱼之一，是我国重要的经济养殖鱼类。据世界粮农组织(FAO)2015年统计，鳙全世界范围内养殖产量达到340万吨，2015年国内鳙的产量已经上升到336万吨，占全世界总养殖产量的98.72％，鳙产量位列我国淡水养殖鱼类总产量的第三位。随着我国居民生活水平的提高，对鱼肉等优质蛋白质的需求越来越大，这将进一步刺激国内鳙养殖业的发展。鳙的性成熟年龄在我国中部和南方约需4-5年，北方至少需6年以上。由于鳙性成熟钱从外观上无法鉴别其性别，性成熟个体也只有在繁殖季节通过其所产配子类型才可准确鉴定其性别，这给鳙的生产和繁殖造成了极大不便。为了在性成熟前提前鉴定鳙的性别，亟需开发鳙性别特异分子标记。简化基因组测序(restrictionsiteassociatedDNAsequencing,RAD-seq)是最近几年发展起来的将酶切和高通量测序相结合的一种技术。它可以通过不同的内切酶，在基因组中酶切产生特异切口片断，将这些片断富集之后作为模板，构建高通量测序文库，然后借助高通量测序，获得大量酶切片断的序列。这种方法既可以获得基因组中大量特定片断，又降低了测序成本，已经成为一种通用而高效的遗传分型方法(Daveyetal.Genome-widegeneticmarkerdiscoveryandgenotypingusingnext-generationsequencing.NatRevGenet.2011.12,7499-510)。虽然该方法已成功运用在多种动物和植物的性别遗传标记开发中，但它还是存在一些明显的缺点，例如它鉴定出来的通常为性别相关SNP标记，存在遗传分型方法比较复杂等不足(Carmichaeletal.Identificationofasex-linkedSNPmarkerinthesalmonlouse(Lepeophtheirussalmonis)usingRADsequencing.PLOSONE.2013.8,10,e77832)。
技术实现思路
针对现有技术中不易鉴定鳙幼鱼性别的缺陷，本专利技术提供一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，并应用该方法鉴定到一条雄鳙特异长序列，基于该长序列开发出一种简便、快速、可靠鉴定鳙的性别的方法，为批量鉴定鳙性别奠定技术基础。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：本专利技术的第一方面提供一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)雄鳙特异短序列的鉴定利用本实验室已有的已知性别的5雌5雄鳙为样品，取尾鳍提取基因组DNA，按照2b-RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用Stacksv1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄鳙中均出现，但是在5尾雌鳙中均没出现，此序列即雄鳙特异短序列，其核酸序列为SEQIDNO:1；(2)雄鳙基因组测序步骤(1)中鉴定到的短序列仅有32bp，无法进行普通PCR引物设计，因此需要更长的基因组序列。于是对5尾雄鳙中的一尾进行高通量全基因组测序，然后使用SoapDenovov1.2.0软件进行从头组装，获得雄鳙全基因组序列；(3)将(1)中获得的雄鳙特异短序列在(2)中获得的雄鳙全基因组序列中进行BLAST比对搜索，获得一条922bp的长序列，此序列的核酸序列为SEQIDNO:2。本专利技术的第二方面，提供一种鳙性别特异分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的第三方面，提供一种鳙性别特异分子标记SEQIDNO:2在鳙性别鉴定中的应用。本专利技术的第四方面，提供一种快速检测鳙性别差异的引物，以SEQIDNO:2为模板进行PCR引物设计，获得一对能够分辨鳙性别的引物，引物名称为ArS-9-1F和ArS-9-1R，引物序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。本专利技术的第五方面，提供一种用所述鳙性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，包括如下步骤：(1)采集待测鳙的基因组DNA；(2)用所述鳙性别特异分子标记的引物对鳙基因组DNA进行PCR扩增，扩增得到366bp的条带所对应的为雄性个体，没有扩增条带所对应的为雌性个体。进一步地，所述步骤(2)中的PCR反应的体系为：DNA模板1μl(50ng/μl)，上下游引物5μMArS-9-1F和ArS-9-1R混合物0.4μl，2.5mMdNTP0.4μl，10XBuffer1.25μl，5U/μlTaq酶0.075μl，补充水至12.5μl。进一步地，所述步骤(2)中的PCR扩增程序为：与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：(1)本专利技术所提供的遗传性别鉴定方法能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行性别的鉴定。该方法不受个体发育时期、环境的影响，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。(2)本专利技术成本低、操作简单、快速、准确，并适合于推广应用。附图说明图1为利用已知性别鳙对引物ArS-9-1进行准确性验证，图2为利用引物ArS-9-1对雌核发育鳙子代进行性别鉴定，图中所示雌核发育鳙子代均为雌性，验证了鳙性别决定机制为XX/XY型。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)雄鳙特异短序列的鉴定利用本实验室已有的已知性别的5雌5雄鳙为样品，提取基因组DNA，按照2b‑RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用Stacks v1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄鳙中均出现，但是在5尾雌鳙中均没出现，此序列即雄鳙特异短序列，其核酸序列为SEQ ID NO:1；(2)雄鳙基因组测序对5尾雄鳙中的一尾进行高通量全基因组测序，然后使用SoapDenovo v1.2.0软件进行从头组装，获得雄鳙全基因组序列；(3)将(1)中获得的雄鳙特异短序列在(2)中获得的雄鳙全基因组序列中进行BLAST比对搜索，获得一条911bp的长序列，此序列的核酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)雄鳙特异短序列的鉴定利用本实验室已有的已知性别的5雌5雄鳙为样品，提取基因组DNA，按照2b-RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用Stacksv1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄鳙中均出现，但是在5尾雌鳙中均没出现，此序列即雄鳙特异短序列，其核酸序列为SEQIDNO:1；(2)雄鳙基因组测序对5尾雄鳙中的一尾进行高通量全基因组测序，然后使用SoapDenovov1.2.0软件进行从头组装，获得雄鳙全基因组序列；(3)将(1)中获得的雄鳙特异短序列在(2)中获得的雄鳙全基因组序列中进行BLAST比对搜索，获得一条911bp的长序列，此序列的核酸序列为SEQIDNO:2。2.根据权利要求1所述的鳙性别特异分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中取尾鳍提取基因组DNA。3.一种鳙性别特异分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：童金苟，刘海洋，付北德，俞小牧，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42