一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，通过利用原核表达载体，在大肠杆菌中大量表达霍乱毒素亚基，然后在体外进行高效复性，得到大量具有生物活性的霍乱毒素B亚基，普通实验室均可操作，无污染。最重要的优点是，可以根据实验需求，进行各种荧光，同位素，示踪剂标记。

Method for preparing cholera toxin B subunit protein with biological activity

The invention discloses a method for preparing bioactive cholera toxin B subunit protein, by using prokaryotic expression vector, expression of cholera toxin subunit in Escherichia coli, then high renaturation in vitro, get a large number of cholera toxin B subunit with biological activity, common laboratory can be operated no pollution. The most important advantage is that a variety of fluorescence, isotope, and tracer markers can be carried out according to experimental requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法
本专利技术涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，具体涉及一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法。
技术介绍
霍乱弧菌(Vibriocholerae)引起一种烈性肠道传染病，表现为腹泻脱水、休克甚至死亡，属于国际检疫传染病。世界卫生组织2016年统计数据显示，全球每年爆发130～400万起霍乱病例，每年因为霍乱造成2.1～14.3万人死亡。霍乱严重危害人类健康，而霍乱毒素(Choleratoxin，CT)是霍乱弧菌分泌的一种具有ADP-核糖基转移酶活性的毒素，是引起腹泻的主要因素。CT是一种典型的AB5结构的毒素，5个B亚基非共价结合成非常紧凑稳定的圆桶状五聚体；A亚基(CTA)呈球形，由CTA1和CTA2两部分组成，CTA1与CTA2由肽键和二硫键相连，CTA2肽插入CTB五聚体的桶状中心，并与B5非共价紧密结合，形成支架将A1与B5连在一起。CT通过CTB与肠道上皮细胞膜GM1受体(单唾液酸神经节苷脂)结合后，内吞经脂质筏运输到达高尔基体(OrlandiandFishman,1998；Wolfetal.,1998)，再到内质网。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，包括下述步骤：将纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：1）含有4M尿素缓冲液透析12‑24小时；所述的含有4M尿素缓冲液的配方为：20mM Tris, 100mM NaCl, 5% Glycerol, 1% Glycine, 5 mM EDTA, 0.1 mM GSSG, 1 mM GSH, 4M Urea，pH 8.5；2）含有2M尿素缓冲液透析12‑24小时；所述的含有2M尿素缓冲液的配方为：20mM Tris, 100mM NaCl, 5% Glycerol, 1% Glycine, 5 mM EDTA, 0.1 mM GSSG, ...

【技术特征摘要】
1.一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，包括下述步骤：将纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：1）含有4M尿素缓冲液透析12-24小时；所述的含有4M尿素缓冲液的配方为：20mMTris,100mMNaCl,5%Glycerol,1%Glycine,5mMEDTA,0.1mMGSSG,1mMGSH,4MUrea，pH8.5；2）含有2M尿素缓冲液透析12-24小时；所述的含有2M尿素缓冲液的配方为：20mMTris,100mMNaCl,5%Glycerol,1%Glycine,5mMEDTA,0.1mMGSSG,1mMGSH,2MUrea，PH8.5；3）含有1M尿素缓冲液透析12-24小时；所述的含有1M尿素缓冲液的配方为：20mMTris,100mMNaCl,5%Glycerol,1%Glycine,5mMEDTA,0.1mMGSSG,1mMGSH,1MUrea，PH8.5；4）不含尿素缓冲液透析10-24小时，并继续透析2-3遍，即得具备活性的霍乱毒素B亚基蛋白；所述的不含尿素缓冲液的配方为：20mMTris,100mMNaCl,PH8.5；以上透析过程中所用透析袋的规格为10KD。2.根据权利要求1所述的方法，所述纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：1）含有4M尿素缓冲液透析24小时；2）含有2M尿素缓冲液透析24小时；3）含有1M尿素缓冲液透析24小时；4）不含尿素缓冲液透析24小时；5）不含尿素缓冲液透析10小时；6）不含尿素缓冲液透析10小时，即得具备活性的霍乱毒素B亚基蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体的浓度为0.2mg/mL。4.根据权利要求1所述的方法，所述的纯化的霍乱毒素B亚基蛋白包涵体的制备方法包括：1）.原核表达载体的构建：将SEQIDNO.1所示核苷酸序列克隆到pET28a-OH载体上，得到CTB-pET28a-OH表达载体；pET28a-OH载体是通过PCR删掉pET-28a（+）的N端His...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓黎，李从刚，裴云山，吴琼，刘买利，
申请(专利权)人：中国科学院武汉物理与数学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42