本发明专利技术提供了一种LT突变体及其亚基的高效表达方法，并提供了应用方法，大肠杆菌热敏感毒素(heat-labile?toxin，LT)是目前世界上公认的免疫效果最好的粘膜免疫佐剂之一，但其有一定毒性且难于大量获得，严重的阻碍了其在人和动物疫苗中的应用。本发明专利技术采用大肠杆菌作为表达宿主制备LT的过程中，LT在大肠杆菌中的表达量非常的低，只有1-5％。本发明专利技术在实验保存的已经去毒的大肠杆菌毒素基因LTm(R192G)的基础上，采用基因工程手段构建了一系列的LT突变体及其A、B亚基原核表达质粒，并进行了表达优化、纯化、活性检测，能构建了8株表达重组菌。经Western?Blotting检测发现所表达的目的蛋白均具有免疫原活性。使LTAm和CBD-LTB的表达量分别达到了35％和30％。再经历一系列方法最终可得到纯度95％以上的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，尤其是属于使用基因技术生产疫苗领域。
技术介绍
传染病(Infectious diseases)肆虐人类的历史已经有数千年之久了。一般来说，传染病是由病原微生物感染机体后所产生的有传染性的疾病。这些病原微生物可以是细菌、病毒、衣原体、支原体，也可以是寄生虫。传染病可以在人与人、人与动物、动物与动物之间相互传染。它的流行过程是传染源(体内有病原体生存、繁殖并能排出病原体的人或动物)将病原体通过一定的途径传染给易感机体，并产生两种结局一种是机体患病或者死亡，治愈者由于疾病本身的自限性获得了一定的抵抗力成为免疫者；另一种是机体表面上未发病，实际上已经感染了病原体，感染了病原体的人无论发病与否，都有可能成为新的传染源，并将病原体再次传染给其他人，成为一个循环。直到上世纪中叶,随着疫苗和抗 生素的应用与发展以及人类生活卫生条件的改善，长期以来一直威胁人类生命与健康的许多慢性传染病都得到了有效的控制，有的甚至在全球范围内被消灭(如天花，脊髓灰质炎等)。但近几年来，世界范围内传染病的发病率再度回升。流行爆发事件接连不断，极大的伤害了公共卫生安全。几乎每年都有一种新的流行传染病发生，如2009年4月爆发的甲型HlNl流感，在全球范围内已经造5000人死亡，目前疫情还有继续蔓延的趋势。此次爆发的新型甲型HlNl流感病毒具有人-人之间传播和致死率高等明显的新的流行病学特征。新发流感的肆虐给人类健康和全球经济的发展造成了巨大危害。另外的某些传染病已经成为全球性的公共卫生问题。流感、感染性腹泻，严重的如人禽流感、疯牛病、传染性肺炎(SARS)等。现在传染病所处的状态是新发传染病不断涌现，原有的传染病在死灰复燃，这样的现实使越来越多的人们开始关注传染病和了解传染病，渴望获得保护自己的方法。纵观历史上对传染病的防治办法，无一例外的都是通过疫苗来实现。疫苗在预防及消灭传染病中对人类作出了极大的贡献。到目前为止，人类对疫苗的研究已经过了数百年，积累了丰富的经验。2007年12月29日，我国在原来使用的乙肝疫苗、卡介苗、脊灰疫苗、百白破疫苗、麻疹疫苗和白破疫苗等6种国家免疫规划疫苗基础上，将甲肝疫苗、流脑疫苗、乙脑疫苗、麻腮风疫苗纳入国家免疫规划，对适龄儿童进行常规接种。在重点地区对重点人群进行出血热疫苗接种；发生炭疽、钩端螺旋体病疫情或发生洪涝灾害可能导致钩端螺旋体病暴发流行时，对重点人群进行炭疽疫苗和钩体疫苗应急接种。通过这些疫苗的按种，乙型肝炎、结核病、脊髓灰质炎、百日咳、白喉、破伤风、麻疹、甲型肝炎、流行性脑脊髓膜炎、流行性乙型脑炎、风疹、流行性腮腺炎、流行性出血热、炭疽和钩端螺旋体病等15种传染病起到了有效的预防作用。同时传染病的不断的发展对疫苗的研究提出了更多新的挑战。经济、稳定、高效的粘膜免疫疫苗已经成为目前国内外疫苗研究的新方向。而在粘膜免疫疫苗中，高效、安全的免疫佐剂是其中的关键所在[2]。安全有效的粘膜免疫佐剂能大大的提高免疫的效果，不仅可诱导全身的体液与细胞免疫应答，还能诱导局部粘膜免疫应答，这对于阻止病原体通过粘膜的传播和感染具有重要的意义；与传统的疫苗相比，粘膜疫苗接种途径与应用方法更为的快捷、简便[3]。传统的免疫方式(如肌肉、皮下及皮内注射)在诱发全身免疫应答的同时却不能产生有效的粘膜局部免疫应答，不能有效控制粘膜感染。为加强局部粘膜免疫，激活粘膜免疫应答，使疫苗发挥最大作用，可通过粘膜进行接种。粘膜疫苗正是在此基础上建立起来的，其使用方便、副作用小、易于让病人接受，由于是通过粘膜进行免疫所以避免了由于重复使用针头可能存在的感染问题。另外粘膜免疫不需专业人员，这对边远地区尤为适用。而且同时避免了肌肉注射所引发的疾病的传染。随着生物工程技术的发展，生产经济、稳定和高效的粘膜免疫佐剂已经成为目前疫苗发展的新趋势。粘膜免疫要取得好的效果，关键是免疫佐剂本身的性质以及其在抗原呈递与免疫应答中的作用。因此开发出安全有效的免疫佐剂已经成为新型疫苗的热点和难点。
技术实现思路
大约70%以上的传染病病原都是通过机体的粘膜侵入体内的，因此粘膜免疫是人类战胜这类传染病的主要武器，也是研发新一代疫苗的主要的方向。粘膜免疫佐剂在粘膜 疫苗的研制中起着关键的作用，而大肠杆菌热敏毒素LT是目前国内外的公认的诱发粘膜免疫效果最强的佐剂，LT及其亚基LTB不仅是很强的口服免疫原，而且具有显著增强宿主特异性免疫应答佐剂作用。但是由于LT自身的毒性，使其作为粘膜免疫佐剂的使用受到了很大的限制，同时，由于新型疫苗的发展，迫切的需要大量的安全、高效的粘膜佐剂，用于多种粘膜疫苗的研制和使用。随着现代分子生物学、分子免疫学、生物信息学以及基因工程的发展，对LT突变体及其亚基作为粘膜佐剂的功能，还需要对其结构和功能与机理方面做进一步的研究和探索。为此，本专利技术在参考国内外有关的基础上，以本专利技术保存的已经通过现代基因工程手段改造过的LTml92突变体为基础，对LT突变体、突变后的A亚基及B亚基，构建了一系列的原核表达载体，通过这些质粒重组子的诱导表达，过程优化与简易纯化，以期望获得能高效生产粘膜免疫佐剂分子的表达和纯化工艺，为研制和生产粘膜免疫佐剂疫苗提供产品和技术。本专利技术为获得理想的表达量，采用克隆的LT及其衍生物的基因保留了自身的SD序列及部分调控基因，通过与不同表达载体重组，初步探索适合LT及其亚基的表达系统。本专利技术成功构建了 pCDFDuet-1-LTB-LTm、pCDFDuet-1-LTm-LTB、pOFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-l-MCSl-LTB、pCDFDuet-l-MCSl-LTm、pTYBll-LTB、pTYBll-LTm 两类原核表达载体，将至转入表达宿主菌种，对表达条件进行初步的探索和优化，筛选出了几个表达量较好的LTm及其蛋白亚基的表达质粒，并对表达的融合蛋白进行了纯化和初步的应用。经与转化空载体的宿主菌对照和采用SDS-PAGE电泳与Western Blotting方法检测发现，在小试试验中BL21 (DE3) /pCDFDuet-1-LTAm-LTB的表达产物LTAm、LTB、分别以包涵体、可溶性形式表达表达量分别达到了 35-40 %和10-15 % ；BL21 (DE3) /P⑶FDuet-I-MCSl-LTm的表达产物情况为LTAm、LTB、分别以包涵体、可溶性形式表达表达量分别达到了 30-35%和 8-10% ；BL21 (DE3)/pCDFDuet-l-LTB-LTm 的表达情况 LTAm 以包涵体形式表达，表达量30-35%，LTB以可溶性形式表达表达量占总菌体蛋白的10-15% ；BL21 (DE3) /pTYBl 1-LTB、BL21 (DE3) /pTYBll-LTB-egfp 表达产物以均以可溶性形式表达，表达量占总蛋白的30%和25%。经Western Blotting检测发现所表达的目的蛋白均具有免疫原活性。本专利技术对工程菌的BL21 (DE3)/pCDFDuet-l-LTAm-LTB、BL21 (DE3)/pTYBll-LTB 的表达条件进行了初步的筛选和优化，使LTAm和CBD-LTB的表达量分别达到了 35%和30%。利用镍离子金属层本文档来自技高网...
【技术保护点】
大肠杆菌热敏感毒素(LT)突变体及其亚基的高效表达方法，其特点在于，采用基因工程手段构建了一系列的LT突变体及其A、B亚基原核表达质粒，并进行了表达优化、纯化、活性检测，能构建了8株表达重组菌。
【技术特征摘要】
1.大肠杆菌热敏感毒素(LT)突变体及其亚基的高效表达方法，其特点在于，采用基因工程手段构建了一系列的LT突变体及其A、B亚基原核表达质粒，并进行了表达优化、纯化、活性检测，能构建了 8株表达重组菌。2.根据权利要求I所述的大肠杆菌热敏感毒素(LT)突变体及其亚基的高效表达方法，其特点在于，采用克隆的LT及其衍生物的基因保留了自身的SD序列及...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘源云，
申请(专利权)人：刘源云，
类型：发明
国别省市：
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