一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法以及克隆不同倍数的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法。所述方法为将人工合成的末端分别含有可以配对的同尾酶的三个双链DNA分子连接到质粒中，两对同尾酶的位点分别被限制性内切酶切除后再连接，形成符合非结晶区氨基酸的三联密码子，转化、筛选获得含有完整类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒，再利用在完整的类家蚕丝素蛋白非结晶区基因5’端和3’端设计的同尾酶进行加倍克隆，转化、筛选获得含有多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的质粒。最后双酶切后得到单倍和多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因。本发明专利技术所述方法操作简便，获得的基因准确性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，尤其涉及及类家蚕丝素蛋白非结晶区基因任意倍数的克隆方法。
技术介绍
家蚕丝素蛋白，又称丝素蛋白，是一种结构蛋白，由包括丝素重链(H链)蛋白、丝素轻链(L链)蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，属于结晶高聚物，分为结晶态和无定形态两大部分。其中，丝素蛋白重链是丝素蛋白的主要部分，全长5363个氨基酸，包括20种氨基酸，富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，其主要包括N末端151个氨基酸残基的非重复区域、核心区域和C末端55个氨基酸残基的非重复区域三个组成部分。而丝素重链的核心区域又分为富含甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)的高度重复区域和非重复的间隔区，其中，高度 重复区域内一般以GAGAGS重复开始，以GAAS终止。非重复间隔区，又称非结晶区，主要为GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFG 的非重复序列。研究表明家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中主要为亲水性氨基酸，其编码的多肽用作美容用品应具有比丝素粉更优的护肤保湿的功效，但是家蚕丝素蛋白非结晶区氨基酸组成中含有光照易生色的酪氨酸和色氨酸，不适合用作护肤品。为了使家蚕丝素蛋白非结晶区能获得更好的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种克隆类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，其特征在于，包括以下步骤 A、合成分别编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Linkl、Link2、Link3三个双链DNA分子；其中Linkl的5，端和3，端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基；Link2的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有NheI位点；Link3的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基； B、将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中，转化感受态细胞，挑克隆，抽提质粒，酶切筛选并测序鉴定获得正确质粒，Nhel/Hindl 11双酶切、琼脂糖凝胶电泳回收小片段即得。2.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述将Linkl、Link2、Link3连接到质粒pSLFA1180FA中的具体步骤包括 a、用限制性核酸内切酶Nhel/Bglll消化质粒pSLFA1180FA，收集大片段，与双链DNA分子Linkl混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSLl ； b、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL1，收集大片段，与双链DNA分子Link2混合，T4DNA连接酶连接后得到质粒PSL2 ； C、用限制性核酸内切酶Nhel/Hindlll消化质粒PSL2，收集大片段，与双链DNA分子Link3混合，T4DNA连接酶连接即得。3.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Linkl的编码链具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。4.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link2的编码链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。5.根据权利要求I所述克隆方法，其特征在于，所述双链DNA分子Link3的编码链具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列。6.一种克隆多倍类家蚕丝素蛋白非结晶区基因的方法，其特征在于，包括以下步骤 I、合成分别编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的Link4、Link5、Link6三个双链DNA分子；其中Link4的5’端和3’端分别含有BglII和NheI的粘末端碱基，在紧接其BglII位点的下游含有AgeI的识别位点；Link5的5’端和3’端分别含有SpeI和HindIII的粘末端碱基，紧接HindIII位点的上游含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建南，裔洪根，黄海燕，杨云星，李明忠，卢神州，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：