弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种弓形虫多表位基因及其与霍乱毒素ＣＴＸＡ２／Ｂ亚基的融合基因，同时还公布了所述基因在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。利用本发明专利技术所述融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种融合基因，尤其涉及一种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B 亚基的融合基因(该基因是编码弓形虫多表位肽和霍乱毒素CTXA2/B亚基的核苷酸序 列)，及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
技术介绍
弓形虫(7bA^77as历a ^W7力7)是一种细胞内寄生原虫，其能引起人兽共患的 弓形虫病。弓形虫是单细胞生物，但其生活史的复杂性，形态的多样性，入侵宿主 的广泛性，造成其不同性质抗原的免疫性以及致病分子的机制均不相同。目前，弓 形虫病的治疗并无特效药物，研制廉价、安全、有效的弓形虫疫苗无疑是预防和控 制弓形虫病的最好途径。动物和人体实验均表明，单一抗原成分为基础的疫苗，往往因为其含有的淋巴 细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体(朋C)限制性比较大，对形态多变、 抗原成分复杂的虫体，难以形成有力攻击。选取某些强保护性抗原中含T淋巴细胞 和(或)B淋巴细胞表位构成的多表位疫苗，是新近发展起来的的疫苗研制趋势。表位是组成蛋白质的抗原决定簇，是抗原分子表面决定该抗原特异性的特殊化学 基团，即抗原分子表面被抗体或T、 B淋巴细胞特异性结和的部位。 一个抗原可以含 有多个表位，而能够引起免疫应答的只是其中部分表位。而且表位与表位之间的剌激 能力并不相同。凡能够诱发强的免疫反应的表位叫做优势决定簇。如果把不同抗原的多个优势决定簇组合到一起，能够对免疫机体形成多层次、多特异性免疫保护，远大 于单个抗原的保护力。多表位基因在对抗原基因成分选择上具有广泛性，并且在具体操作上也因各种 先进的分子生物学手段和完善的基因工程技术而成为可能，因此，选取弓形虫多表 位基因作为诱导宿主免疫应答的主要靶点，具有高度的免疫原性和免疫保护性，此 为制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗奠定了基础。但经检索，关于弓形虫多表位基因 以及与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，及其它们在制备预防和治疗弓形虫病核酸 疫苗中的应用目前还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种弓形虫多表位基因与霍乱 毒素CTXA2/B亚基的融合基因及其制备方法，以及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸 疫苗中的应用。本专利技术所述弓形虫多表位基因，它具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度225碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(C)假设否(d) 反义否(e) 最初来源弓形虫(7bArop7aana ^ "力7J(f) 序列描述SEQ ID NO. 1atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60 gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attg鄉agc tgttcaatcg tataccggaa 120 acaagcgtag gtaacgttgg ttc幼ctgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagactcg 180 tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcag 225本专利技术所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，它具有 SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；其所示信息为(a) 序列特征*长度740碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b) 分子类型CDNA (C)假设否(d) 反义否(e) 最初来源弓形虫(7b^ A^5ffla 与霍乱毒素(CAoJera towV )(f) 序列描述SEQ ID NO. 2atgacctgcccagataaaaaatcgacagccggtccggatactatgaaaagcatgcagagg60gacgaggacaagggtcctggagacgtcgtcattgaggagctgttcaatcgtataccggaa120acaagcgtaggtaacgttggttcaactgaagatagtgggcttacaggcgtcaaagaccgt180tcatccaagggtattttgccaaaattaactgagaacccgtggC3gggt3Ccagtaatact240tgcgatgaaa3肪cccaaagtctaggtgtaaaattccttgacgaataccaatctaaagtt300aaaagacaatatttttcaggctatcaatctgatattgatacacataatagaattaaggat360gaattatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatg420cacatggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcaga3t3cc3caac4803t3CgCt33atataagstaittttcgtatacagaatctctagctggaaaaagag卿tggc540tatcattacttttaagaatggtgcaatttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatat600Elg3ttC3C33aaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttac660tgaagctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgc720aattagtatggcaaattaa740本专利技术设计的弓形虫多表位基因所选取的基因片段为弓形虫速殖子、缓殖子的T、 B细胞表位，作为诱导宿主免疫应答的主要耙点，具有高度的免疫原性和免疫保 护性。具体地讲是从弓形虫基因组中优选了 5个高度保守的HLA识别多肽，并在各表位间用甘氨酸和脯氨酸分割以保证各表位基本独立。本专利技术设计的弓形虫多表位基因不 但包含了具有T、 B细胞刺激功能的保护性表位，还加入了CpG岛基序，有助于细胞 免疫功能的发挥和T、 B细胞间的协同作用。经过生物信息学分析，此多表位基因具 有高度的抗原性，为诱导高效的免疫应答打下了良好的基础。本专利技术所述的弓形虫多表位基因由invitrogen公司一次性合成。 本专利技术所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因是通过聚合 酶链反应(PCR)扩增获得的首先，根据弓形虫多表位基因(MEG)与霍乱毒素基因(CTXA2/B)设计两对引物为MEG: Pl: 5， -CG GGATCC MGCTT ATG ACC TGC CC-3，P2: 5， - GGTACC CTG CCA CGG GT-3，CTXA2/B: P3: 5' - GGTACC AGT AAT ACT TGC GA-3'P4: 5， -AC GAA TTC TTA ATT TGC CAT AC-3，分别扩增弓形虫多表位基因MEG与霍乱毒素CTXA2/B基因片段。再以这两个基因为 模板，以P1和P4为引物进行第二次PCR反应得到MEG"CTXA2/B融合基因。PCR反应条件为:94"C预变性5min, 9化,60s;551C, 30s， 72^C60s, 30个循环, 最后72iC延伸10min。扩增完毕，产物经1%琼脂糖电泳、E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种弓形虫多表位基因，它具有ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示的核苷酸序列；其序列是：ａｔｇａｃｃｔｇｃｃｃａｇａｔａａａａａａｔｃｇａｃａｇｃｃｇｇｔｃｃｇｇａｔａｃｔａｔｇａａａａｇｃａｔｇｃａｇａｇｇ６０　 　ｇａｃｇａｇｇａｃａａｇｇｇｔｃｃｔｇｇａｇａｃｇｔｃｇｔｃａｔｔｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａａｔｃｇｔａｔａｃｃｇｇａａ１２０ａｃａａｇｃｇｔａｇｇｔａａｃｇｔｔｇｇｔｔｃａａｃｔｇａａｇａ ｔａｇｔｇｇｇｃｔｔａｃａｇｇｃｇｔｃａａａｇａｃｔｃｇ１８０ｔｃａｔｃｃａａｇｇｇｔａｔｔｔｔｇｃｃａａａａｔｔａａｃｔｇａｇａａｃｃｃｇｔｇｇｃａｇ２２５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丛华，袁泉，丛海滋，古钦民，赵群力，李瑛，周怀瑜，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]