肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽，所述多肽为七肽，其氨基酸序列为Asn‑Thr‑Gly‑Ser‑Pro‑Tyr‑Glu。还公开了其制备方法和应用。本发明专利技术提供的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽，能够与肝癌微球体细胞进行特异性结合，与肝癌微球体靶向结合的能力强，具有高亲和力和高特异性，且对细胞的生长无影响。本发明专利技术的制备方法是以HCCLM3细胞悬浮培养的肝癌微球体为靶细胞，贴壁培养的HCCLM3细胞和LO2细胞为吸附细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选。本发明专利技术制备方法中库容量大，筛选成功率高，操作简单，成本低。本发明专利技术所筛选到的多肽可用于制备肝癌癌栓诊断试剂或肝癌靶向治疗药物。

Liver cancer microsphere cell surface specific targeting polypeptide, preparation method and application thereof

The invention discloses a microsphere HCC cell surface specific targeting peptides, polypeptides of seven peptides with the amino acid sequence of Asn Thr Gly Ser Pro Tyr Glu. Also disclosed are their preparation methods and applications. The present invention provides microspheres HCC cell surface specific targeting peptides, can specifically bind with hepatoma carcinoma cells and hepatoma microspheres, microspheres targeting binding ability, with high affinity and high specificity, and no influence on cell growth. The preparation method of the invention is that the hepatoma microsphere in HCCLM3 cell suspension culture is used as the target cell, the adherent culture HCCLM3 cells and the LO2 cells are the adsorption cells, and the phage display technique is used for differential screening. The preparation method of the invention has the advantages of large library capacity, high screening success rate, simple operation and low cost. The polypeptide screened by the invention can be used for preparing a liver cancer embolus diagnostic reagent or a targeted therapeutic drug for liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽及其制备方法和应用，具体属于生物

技术介绍
肝癌合并癌栓(cancerembolus)在临床的发生率很高，而且往往预后不良，诊断和治疗非常棘手。研究认为，肝癌癌栓是有肝癌干细胞(hepaticcanerstemcell，HCSC)在门静脉或胆管微环境下诱导产生，同时保留了一些干细胞的原始分化特性。肝癌微球体(HepatomaMicrospheres)是研究肝癌干细胞的理想模型，同时也表现出癌栓的特性，成为研究癌栓的理想模型。以癌栓作为靶点进行诊断和治疗，是目前肝癌合并癌栓临床努力的方向，寻找靶向癌栓的分子，则是其中的关键环节。在肿瘤靶向治疗研究中，特异性的多肽类小分子受到了越来越多的关注。抗体类作为诊断和治疗癌症的靶向配体，难以穿透被致密基质包裹的肿瘤细胞且成本高、分子量大、结构复杂，有免疫原性等问题。与之相比，多肽类分子具有亲和力高、特异性高、相对分子质量小、易于合成加工、毒性低、生物相容性好等优点，具有良好的应用前景。在筛选与靶标分子或细胞特异性结合多肽的众多技术中，噬菌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽，其特征在于：所述多肽为七肽，其氨基酸序列为Asn‑Thr‑Gly‑Ser‑Pro‑Tyr‑Glu。

【技术特征摘要】
1.肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽，其特征在于：所述多肽为七肽，其氨基酸序列为Asn-Thr-Gly-Ser-Pro-Tyr-Glu。2.根据权利要求1所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽，其特征在于：所述多肽为环状的环七肽，其结构式为：cyclo-(Asn-Thr-Gly-Ser-Pro-Tyr-Glu)。3.如权利要求1或2所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)贴壁细胞及肝癌微球体的培养；(2)以HCCLM3细胞悬浮培养的肝癌微球体为靶细胞，贴壁培养的HCCLM3细胞和LO2细胞为吸附细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选；(3)经DNA测序确定目标多肽。4.根据权利要求3所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，贴壁细胞培养具体为：人肝癌细胞株HCCLM3用含15％FBS的MEM培养基培养，人正常肝细胞LO2用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养；取对数生长期的HCCLM3细胞及LO2细胞，常规消化后按1×106/皿接种于6cm培养皿中，置于37℃、含体积浓度为5％的CO2条件下培养至细胞贴壁长满皿底，备用。5.根据权利要求3所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，肝癌微球体培养具体为：取5×105个处于对数生长期的HCCLM3细胞于超低吸附培养瓶中进行悬浮培养，每7mL培养体系中含有：6776μL的DMEM-F12培养基、140μL的B27为、70μL的肝素、终浓度为100μg/mL的hEGF和终浓度为50μg/mL的bFGF，细胞置于37℃、体积浓度为5％的CO2条件下的培养箱中培养48h，得到肝癌微球体，备用。6.根据权利要求3所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)以HCCLM3细胞悬浮培养的肝癌微球体为靶细胞，贴壁培养的HCCLM3细胞和LO2细胞为吸附细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，具体为：(2.1)取贴壁长满皿底的LO2细胞，PBS洗3次，加入BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中封闭30min，随后用PBST缓冲液洗LO2细胞3次；吸取噬菌体原始肽库溶液并与PBS混匀得到混合液；将该混合液加入贴壁生长的LO2细胞中，在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中孵育1h；转出上清液至一个新的1.5mLEpp管中，备用；(2.2)取贴壁长满皿底的HCCML3细胞，PBS洗3次，加入BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中封闭30min，随后用PBST缓冲液洗贴壁生长的HCCLM3细胞3次，加入步骤(2.1)保留的上清液，继续在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中孵育1h，转出上清液至一个新的1.5mLEpp管中，备用；(2.3)将步骤(1)中肝癌微球体培养物吸至10mL离心管中，离心，吸弃陈旧培养基；微球体用PBS洗3次，离心，吸弃PBS；加入BSA，小心吹打混匀后，将混悬液吸至一个新的6cm培养皿中，在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中封闭30min；随后将混悬液吸至一个新的10mL离心管中，离心，吸弃上清液；用PBST缓冲液洗微球体3次，离心，弃上清液；加入步骤(2.2)保留的上清液，轻轻吹打混匀后，将混悬液吸至一个新的6cm培养皿中，在37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中孵育1h；随后将混悬液吸至一个新的5mL离心管中，离心，吸弃上清液；再用PBST缓冲液洗微球体6次，离心，吸弃上清液；随后在细胞沉淀中加入pH＝2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，轻轻吹打混匀后，置于37℃、50rpm条件下，恒温培养振荡器中洗脱10min；随后离心，将上清液转入一个新的1.5mLEpp管内，加入pH＝9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和，测定洗脱液中所含噬菌体滴度，随后取该洗脱液进行扩增，扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化，并测定扩增、纯化后噬菌体滴度，完成第一轮筛选；(2.4)重复以上步骤数次，筛选结束。7.根据权利要求6所述的肝癌微球体细胞表面特异性靶向多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)以HCCLM3细胞悬浮培养的肝癌微球体为靶细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘扬，陈腾祥，洪阳，张金娟，王晋星一，陈妮，刘伟，兰金芝，朱晨蕾，孙密欣，唐佳艳，王寒琪，郭蔓岚，曾志锐，雷珊，严莉莎，钟钰，徐澍，毛大华，杨琼，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52