人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用。方法如下：称取壳聚糖50‑400mg，溶解于25‑200mL的稀醋酸中，得到壳聚糖溶液，称取人间充质干细胞源外泌体冻干粉1‑10mg、葡糖氨基葡聚糖2‑20mg、透明质酸2‑20mg，溶解于10‑100mL甘油中，得到外泌体溶液；将外泌体溶液滴加到壳聚糖溶液中，得到外泌体的壳聚糖纳米颗粒混悬液；将混悬液进行离心处理，收集沉淀物，洗涤并干燥处理，得到美容制剂。解决人们的皮肤老化问题。克服了频繁使用的问题，有利于降低美容制剂的不良反应，能在较长时间内维持活性成分的有效浓度，用最小剂量达到最大疗效。

Preparation method and application of human mesenchymal stem cell derived exocrine biological active preparation

The invention belongs to the field of biological medicine, in particular to a preparation method and application of a human body mesenchymal stem cell extracellular secretion biological active preparation. The method is as follows: the chitosan 50 400mg dilute acetic acid dissolved in 25 200mL, obtained chitosan solution, the human mesenchymal stem cells derived exosomes freeze-dried powder 1 10mg, glycosaminoglycans 2 20mg, 2 20mg hyaluronic acid, dissolved in 10 100mL glycerol in the obtained exosome exosome solution; the solution is dripped into chitosan solution, chitosan nanoparticles obtained exosome suspension; the suspension was centrifuged and the precipitate was collected, washed and dried, get cosmetic preparations. Solve people's skin aging problems. Overcome the frequent use of the problem, is conducive to reducing the adverse effects of beauty preparations, can maintain the effective concentration of active ingredients for a long time, with the minimum dose to achieve maximum efficacy.

【技术实现步骤摘要】
人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用。
技术介绍
众所周知，正常细胞，以及肿瘤细胞，都需要通过细胞分泌载体进行细胞间通信，以维持生理状态和活动。其中，外泌体是一种重要的细胞间通信载体，能够由所有种类的细胞产生，并已经被发现于各类体液当中，包括血液、淋巴液、尿液和乳汁。近三十年的研究结果表明，外泌体携带着丰富的细胞源物质，包括脂质体、蛋白质、mRNA、非编码RNA，乃至DNA片段。外泌体并非简单的细胞分子垃圾，它们能够被其他细胞所吸收。因此，外泌体可以在细胞间传递生物信息，从而在细胞生理功能方面扮演着重要角色。特别地，外泌体也参与了某些疾病的进展过程，包括肿瘤和神经退行性疾病。随着对外泌体的研究不断深入，人们对于外泌体在人类健康与疾病方面极其复杂和深奥的作用机理，有了很深刻的认识和理解，进而开始留意外泌体对于疾病防治、人体保健，尤其是抗衰老方面的临床应用和美容应用。外泌体参与人体正常生理活动中的维持阶段，例如干细胞的维持，以及组织修复。研究表明，在人体的发展和分化过程中，外泌体起着形态发生因子转移载体的作用。这些外泌体首先由供体细胞释放，然后在邻近组织周围扩散，形成不同的浓度带，最后完成细胞间通信的过程。特别重要的是，已有多项研究发现，干细胞释放的外泌体对于受伤组织，尤其是老化皮肤的再生与复原，起着十分关键的作用。现有技术中，大多数美容制剂的抗衰老效果不理想，而且美容效果维持时间较短，需要经常使用，人力成本和时间成本较高。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有的美容制剂抗衰老效果不明显，很少用到外泌体作为原料的技术瓶颈，从而提出一种人间充质干细胞源外泌体的缓释美容制剂的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法，所述制剂的制备方法如下：1)称取壳聚糖50-400mg，溶解于25-200mL的稀醋酸中，得到壳聚糖溶液；2)称取人间充质干细胞源外泌体冻干粉1-10mg、葡糖氨基葡聚糖2-20mg、透明质酸2-20mg，溶解于10-100mL甘油中，得到外泌体溶液；3)将所述的外泌体溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，得到外泌体的壳聚糖纳米颗粒混悬液；5)将所述混悬液进行离心处理，收集沉淀物，然后洗涤并干燥处理，得到所述源外泌体缓释美容制剂。优选的，所述壳聚糖为200mg，稀醋酸为100mL，人间充质干细胞源外泌体冻干粉为5mg、葡糖氨基葡聚糖为10mg、透明质酸为10mg，甘油为50mL。优选的，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-RNA、所述外泌体源细胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一种。优选的，所述外泌体的获取方法步骤如下：a)对人间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；b)对培养后的干细胞进行预处理；c)在预处理后的培养基的上清液中提取所述人脐带间充质干细胞源外泌体。5、如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述步骤1)中，所述稀醋酸浓度为0.5％。优选的，所述步骤4)中，所述离心处理的速度为10000r/min，时间为30分钟；所述步骤3)的反应时间为30分钟；所述步骤4)中，所述洗涤的次数为3次。优选的，所述所述预处理的具体步骤为：1)将人传代MSC进行无血清悬浮培养，并调整细胞浓度为1.0×106/ml；2)按照106/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％，培养时间为2-3天；3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-MEM液体培养基对培养皿进行洗涤；4)在150mm培养皿中再次加入20ml的alpha-MEM；5)依次加入重组人干扰素、PDGF-BB和EPO；7)在37℃，5％的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液。优选的，所述MSC培养液中干扰素的浓度为10U/ml～600U/ml、PDGF-BB的浓度为2ng/ml～60ng/ml，EPO的浓度为0.1IU/ml～5IU/ml。优选的，所述步骤2)的预处理的具体为：1)取所述MSC培养液的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；2)然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。更为优选的，所述步骤3)具体为：1)取容积为5体积份的离心管，加入1体积份的外泌体分离试剂；2)加入4体积份的经过预处理后的上清液，充分混匀；3)静置处理后，再进行两次离心处理，得到所述外泌体。本专利技术还公开了任一项所述制备方法在生物美容制剂制备领域中的应用。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本专利技术将人间充质干细胞源外泌体作为活性成分，制备了一种有明显效果的缓释美容制剂，能够在一定程度上解决人们的皮肤老化问题。通过激光、超声、机械等方法导入皮肤，解决人们的皮肤老化问题。能在较长时间内维持活性成分的有效浓度，用最小剂量达到最大疗效，从而节省使用者的时间和成本；具有极大的市场前景和经济价值。具体实施方式实施例实施例1本实施例公开了一种美容制剂的配备方法，具体步骤如下：1)称取壳聚糖200mg，溶解于100mL0.5％的稀醋酸中，得到壳聚糖溶液。2)称取人间充质干细胞源外泌体冻干粉5mg、葡糖氨基葡聚糖10mg、透明质酸10mg，溶解于50mL甘油中，得到外泌体溶液。3)在持续搅拌下，将外泌体溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，反应30分钟，即得外泌体的壳聚糖纳米颗粒混悬液。4)将混悬液于4下高速离心(10000r/min)30分钟，收集沉淀物，并用注射用水洗涤3次，干燥后即得人间充质干细胞源外泌体缓释美容制剂。实施例2本实施例公开了实施例1中所述外泌体的冻干粉制备方法取外泌体，加入甘露醇(1％～15％)，混匀，过滤(0.22μm)，分装，再放置于超低温冰箱(-80℃)10h。然后，在10Pa的真空度下进行冻干(-50℃，24h)，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉。实施例3本实施例公开了实施例2中所述外泌体的制备方法A.人MSC的培养及预处理过程：1.材料及试剂1)人脐带、胎盘、骨髓、脂肪或其它来源的MSC，传代次数在6代以内均可。2)人MSC无血清培养基3)alpha-MEM4)重组人干扰素5)重组人EPO6)重组人PDGF-BB7)培养皿(直径150mm)8)其它耗材B.细胞的培养过程1)将人传代MSC消化后计数，使用MSC无血清完全培养基悬浮，调整细胞浓度为1.0×106/ml。2)按照106/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-MEM液体培养基对培养皿进行洗涤。4)加入alpha-MEM20ml/150mm培养皿。5)首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。重组人干扰素(终浓度为10U/ml～600U/ml)、PDGF-BB(2ng/ml～60ng/ml)及EPO(0.1IU/ml～5IU/ml)。7)37℃，5％CO2条件下培养96小时。8)收集上清进行以下处理。如不能及时处理，将上清置于-80℃保存。C.人MSC培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂的制备方法如下：1)称取壳聚糖50‑400mg，溶解于25‑200mL的稀醋酸中，得到壳聚糖溶液；2)称取人间充质干细胞源外泌体冻干粉1‑10mg、葡糖氨基葡聚糖2‑20mg、透明质酸2‑20mg，溶解于10‑100mL甘油中，得到外泌体溶液；3)将所述的外泌体溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，得到外泌体的壳聚糖纳米颗粒混悬液；4)将所述混悬液进行离心处理，收集沉淀物，然后洗涤并干燥处理，得到所述源外泌体缓释美容制剂。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂的制备方法如下：1)称取壳聚糖50-400mg，溶解于25-200mL的稀醋酸中，得到壳聚糖溶液；2)称取人间充质干细胞源外泌体冻干粉1-10mg、葡糖氨基葡聚糖2-20mg、透明质酸2-20mg，溶解于10-100mL甘油中，得到外泌体溶液；3)将所述的外泌体溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，得到外泌体的壳聚糖纳米颗粒混悬液；4)将所述混悬液进行离心处理，收集沉淀物，然后洗涤并干燥处理，得到所述源外泌体缓释美容制剂。2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述壳聚糖为200mg，稀醋酸为100mL，人间充质干细胞源外泌体冻干粉为5mg、葡糖氨基葡聚糖为10mg、透明质酸为10mg，甘油为50mL。3.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-RNA、所述外泌体源细胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一种。4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述外泌体的获取方法步骤如下：1)对人间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；2)对培养后的干细胞进行预处理；3)在预处理后的培养基的上清液中提取所述MSC外泌体。5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述步骤1)中，所述稀醋酸浓度为0.5％。6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述步骤4)中，所述离心处理的速度为10000r/min，时间为30分...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘家权，张涤平，郭子宽，陈贤光，钱开诚，鲁立，
申请(专利权)人：深圳市赛欧细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44