本发明专利技术提供了一种测定83b1血浆浓度的UHPLC‑MS/MS分析方法。首先量取空白血浆，加入83b1标准溶液，震荡，再加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，进行LC‑MS/MS分析，以不同浓度的83b1的峰面积与内标氯雷他定的峰面积之比为纵坐标，以83b1的血药浓度为横坐标进行直线回归，建立标准曲线；然后量取待测血浆，加入柠檬酸钠缓冲液和内标，采用液液萃取方法前处理后，进行LC‑MS/MS分析，利用标准曲线计算出待测血浆样本中83b1浓度。本方法操作简便，处理时间短，高效稳定，安全无毒，检测技术灵敏度高，分析时间短且准确度和精密度高，能达到临床应用沙利度胺药物浓度监测的目的。
【技术实现步骤摘要】
一种测定83b1血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法
本专利技术属于药物血浆浓度分析
更具体地，涉及一种测定83b1血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法。
技术介绍
83b1是一种8-羟基喹啉衍生物，是专利技术人团队前期研究出的一种潜在新药，化合物的结构式如下所示：初步的细胞毒性实验（MTS法）显示该化合物具有抗癌作用。而过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）是83b1最有可能的靶点之一。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)属于核激素受体超家族，存在三种亚型，PPARα，PPARδ（也叫β）和PPARγ。其中PPARα在肝脏中高水平表达，PPARγ在脂肪组织中大量表达，而PPARδ在大多数肿瘤细胞中过表达。最近的研究表明，PPARδ在癌症病变中可能起作用，并且与肿瘤细胞的分化、炎症和细胞生长有关。实时定量PCR间接检查COX-2（环氧合酶-2）基因的mRNA表达，最后ELISA检查衍生的PGE2（前列腺素E2），证明83b1能够降低COX-2基因的表达水平，从而抑制降低PGE2蛋白的表达水平以实现抑制食管鳞状细胞癌的生长。因此，83b1作为一种新药，尤其是抗癌新药的开发，具有很好的前景。目前，83b1尚处于新药研究开发阶段，而在此研究和评价过程中，亟需一种快速稳定的83b1血药浓度检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，建立一种快速、灵敏度高、准确度和精密度高的LC-MS/MS法检测大鼠血浆中83b1浓度的方法，可用于该化合物血药浓度测定，满足83b1临床前药代动力学评估研究的需要。本专利技术的目的是提供一种测定83b1血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种测定83b1血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：S1.精密量取空白血浆，加入83b1标准溶液，震荡，再加入内标氯雷他定（Loratadine）标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC-MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以不同浓度的83b1的峰面积与内标氯雷他定的峰面积之比为纵坐标，以83b1的血药浓度为横坐标进行直线回归，建立标准曲线；S2.待测血浆样本检测：精密量取待测血浆样本，加入等体积柠檬酸钠缓冲液，加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC-MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出待测血浆样本中83b1浓度。其中优选地，步骤S1所述中，制备83b1标准溶液和内标氯雷他定标准溶液时，溶解并稀释标准品所用的溶剂为乙腈。优选地，步骤S1所述83b1标准溶液的配制方法为：83b1对照品溶解于乙腈溶液中，震荡摇匀，得标准储备液，再用甲醇/水=1/1稀释液溶液梯度稀释成一系列浓度的标准溶液。更优选地，步骤S1所述83b1标准溶液的配制方法为：精密称取83b1对照品，溶解于乙腈溶液中，震荡摇匀，得2mg/mL（2000ng/μL）的标准储备液，再用甲醇/水=1/1稀释液溶液梯度稀释，制备浓度分别为60、30、10、5、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005ng/μL的83b1标准溶液。优选地，步骤S1所述内标氯雷他定标准溶液的配制方法为：氯雷他定（Loratadine）标准品溶解于乙腈溶液中，震荡摇匀，得标准储备液，使用前用甲醇/水=50/50（v/v）稀释成标准溶液。更优选地，步骤S1所述内标氯雷他定标准溶液的配制方法为：精密称取氯雷他定（Loratadine）标准品，溶解于乙腈溶液中震荡摇匀，得3mg/mL（3000ng/μL）的标准储备液，置于冰箱－20℃保存；使用前用甲醇/水=50/50（v/v）稀释成0.3mg/ml标准溶液。另外优选地，步骤S1中，空白血浆：83b1标准溶液：内标氯雷他定标准溶液=8～10：1：1（最优选为9：1：1）。优选地，步骤S2所述待测血浆样本和内标氯雷他定标准溶液的体积比为8～12：1（最优选为10：1）。优选地，步骤S1所述震荡的时间为15～30s（最优选为20s）。优选地，步骤S1所述液液萃取方法前处理选用的萃取剂为乙酸乙酯。优选地，步骤S2所述液液萃取方法前处理选用的萃取剂为正己烷：甲基叔丁醚的体积比=3：7。进一步优选地，步骤S1所述液液萃取方法前处理的具体方法为：加入内标后，涡旋混匀，加入乙酸乙酯，涡旋震荡，静置后离心，吸取有机层，室温下真空挥干，加入体积比9：1的乙腈-水溶液进行溶解，离心得供试品，用于UHPLC-MS/MS分析。步骤S2所述液液萃取方法前处理的具体方法为：加入内标后，涡旋混匀，加入正己烷：甲基叔丁醚=3：7，涡旋震荡，静置后离心，吸取有机层，室温下真空挥干，加入体积比9：1的乙腈-1%甲酸水溶液进行溶解，离心得供试品，用于UHPLC-MS/MS分析。步骤S1和S2所述液液萃取方法前处理中，优选地，所述涡旋混匀的时间均为5～15s，所述涡旋震荡的时间均为30～90s，所述静置的时间均为2～4min，所述离心的条件均为16000rpm离心3～5min。更优选地，所述涡旋混匀的时间均为10s，所述涡旋震荡的时间均为60s，所述静置的时间均为3min，所述离心的条件均为16000rpm离心3～5min。作为一种最优选的实施方案，步骤S1所述液液萃取方法前处理的具体方法为：取标准溶液10µl加入90µl空白大鼠血浆，震荡20s，加入氯雷他定溶液10µL，涡旋10s混匀，加入0.5mL乙酸乙酯，涡旋60s，静置3min，16000rpm离心3min，吸取400µL有机层，室温下真空挥干，加入300µL乙腈-水（9:1，v/v）溶解，16000rpm离心5min，得供试品用于UHPLC-MS/MS分析。步骤S2所述液液萃取方法前处理的具体方法为：待测血浆样品100µL，加入等体积柠檬酸钠缓冲液，加入内标氯雷他定溶液10µL，涡旋10s混匀，加入0.5ml正己烷：甲基叔丁醚=3：7，涡旋震荡60s，静置3min，16000rpm离心3min，吸取450µL有机层，室温下真空挥干，加入300µL乙腈-1%甲酸水（9:1，v/v）溶解，16000rpm离心3min，得供试品用于UHPLC-MS/MS分析。另外，优选地，步骤S1和S2所述LC-MS/MS分析方法中，采用以下色谱条件进行洗脱：色谱柱C18XTerraMS（5μm,150×2.1mm.Waters,USA）；流动相：体积比9：1的乙腈-1%甲酸水；流速0.3mL·min-1；进样量5μL；柱温40℃；MRM模式：83b1：m/z321.96→m/z162.84；氯雷他定：m/z383.02→m/z259.12。优选地，步骤S1和S2所述LC-MS/MS分析方法中，采用ESI源离子化；83b1的定量子离子为162.8m/z，定性子离子为84.1m/z，内标的定量子离子为259.1m/z。优选地，所用到的水均为超纯水，所有有机试剂均为HPLC级。本专利技术探究并优化了高效的样本前处理方法，并通过优化色谱和质谱条件，建立UHPLC-MS/MS法测定83b1在SD大鼠血浆中的含量，以氯雷他定作为内标物，缩短分析时间且提高了分析的准确性。本专利技术具有以下有益效果：本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定83b1血浆浓度的UHPLC‑MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.精密量取空白血浆，加入83b1标准溶液，震荡，再加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC‑MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以不同浓度的83b1的峰面积与内标氯雷他定的峰面积之比为纵坐标，以83b1的血药浓度为横坐标进行直线回归，建立标准曲线；S2.待测血浆样本检测：精密量取待测血浆样本，加入等体积柠檬酸钠缓冲液，加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC‑MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出待测血浆样本中83b1浓度。
【技术特征摘要】
1.一种测定83b1血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.精密量取空白血浆，加入83b1标准溶液，震荡，再加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC-MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以不同浓度的83b1的峰面积与内标氯雷他定的峰面积之比为纵坐标，以83b1的血药浓度为横坐标进行直线回归，建立标准曲线；S2.待测血浆样本检测：精密量取待测血浆样本，加入等体积柠檬酸钠缓冲液，加入内标氯雷他定标准溶液，采用液液萃取方法前处理后，利用LC-MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出待测血浆样本中83b1浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述中，制备83b1标准溶液和内标氯雷他定标准溶液时，溶解并稀释标准品所用的溶剂为乙腈。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述83b1标准溶液的配制方法为：83b1对照品溶解于乙腈溶液中，震荡摇匀，得标准储备液，再用甲醇/水=1/1稀释液溶液梯度稀释成一系列浓度的标准溶液；步骤S1所述内标氯雷他定标准溶液的配制方法为：氯雷他定标准品溶解于乙腈溶液中，震荡摇匀，得标准储备液，使用前用甲醇/水=50/50稀释成标准溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，空白血浆：83b1标准溶液：内标氯雷他定标准溶液=8～10：1：1；步骤S2所述待测血浆样本和内标氯雷他定标准溶液的体积比为8～12：1。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述液液萃取方法前处理选用的萃取剂为乙酸乙酯，步骤S2所述液液萃取方法前处理选用的萃取剂为...
【专利技术属性】
技术研发人员：温鼎声，赵真真，姜福林，钟国平，黄民，
申请(专利权)人：广州中大南沙科技创新产业园有限公司，中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。