功能性植物多糖的修饰方法技术

一种功能性植物多糖的修饰方法，由生物学活性的植物中提取功能性多糖，经分离纯化明确分子量和生物学功能后，用试剂进行结构修饰，活化糖链上的活泼羟基，连接小分子聚乙烯亚胺，经透析冰冻干燥而获得的功能性植物多糖。修饰方法简单高效，回收率高，既保留天然多糖原有活性，又增加新的生物学功能，成为一类非病毒性基因载体材料的天然高分子化合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一类天然高分子材料，具体是涉及一类功能性植物多糖修饰方法。技术背景多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是一切 有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来,植 物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现,各种 多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。多糖具有复杂的 结构,这是因为它具有许多不同单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键,能形成具有 不同的构象、不同的相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。特别值得注意的是多糖 分子结构中存在大量的活性羟基，用特殊的交联剂活化后，能连接不同的化合物，从而增加 新的功能。基因药物治疗是近二十年来兴起的新型治疗方法，其基本策略是将外源基因通过各类载 体导入目的细胞并得到有效表达，从而达到治疗疾病的目的。在基因药物释放体系中，载体 的研究始终是研究的热点。目前普遍应用的病毒载体介导系统，虽然其有很高的基因转染效 率，但细胞毒性、较低的靶向性、限制DNA的携带能力、生产包装及高价格等问题限制了病 毒载体的应用范围，尤其是1999年，美国基因治疗临床实验因使用腺病毒载体导致"Jesse Gelsinger"死亡事件，使研究者在病毒类载体的临床使用上更为谨慎。相反，非病毒性转基 因载体具有免疫反应低，安全性能高，易于人工合成等特点，在基因药物的研究中日益受到 重视。非病毒型基因载体存在着毒性、生物相容性、降解性等问题，目前有一种合成的材料聚 乙烯亚胺(PEI)，实验发现分子量22000—25000的聚乙烯亚胺转染效率非常高，但是存在毒 性和降解性的问题，小分子量(600， 1200， 2000)的聚乙烯亚胺毒性小，易于在生物体内代谢，但是几乎没有转染效率。Kim (Kazuyoshi Sagara and Sung Wan Kim Journal of Controlled Release, Volume 79， Issues卜3， 19Februaiy 2002， Pages 271-281)课题组，报导了用低分子量聚乙烯亚胺修饰聚乙二醇提高聚乙烯 亚胺的转染效率，降低聚乙烯亚胺的毒性；Gosselin (Gosselin MA, Guo WJ, Lee RJ，BIOCONJUGATE CHEMISTRY 12 (6): 989-994 NOV-DEC 2001 )等，通过双硫键将低分子量的聚乙烯亚胺连接起来，得到的交联产物在体外转染实验中转染效率比25KD的聚乙烯亚胺高2倍，而 毒性与低分子量聚乙烯亚胺类似；Kam W. leong (Kam W. leong ， etc, Bioconjug Chem. 2006 Jan-Feb;17(l):152-8.)课题组用低分子量的聚乙烯亚胺偶合壳聚糖作为基因药物载体；Yi-Yan Yang ( Peggy Chan，MotoichiKurisawa,JooEun Chung and Yi画Yan Yang ， 5/簡她n我i^ /wwe ^/^""^"Mao^OKi^MJ^-JW)课题组，报导了用聚乙二醇偶合壳聚糖作为基因药物载 体。本专利技术以功能性植物多糖为骨架，用特殊的连接试剂进行修饰，连接低分子量的聚乙烯 亚胺作为新型非病毒基因药物载体。其优点在于修饰后的功能性植物多糖具有可生物降解、 低毒性和高的基因转染效率。
技术实现思路
本专利技术目的是提供，经化学修饰获得功能性植物多糖，使功 能性多糖材料既保留天然多糖原有活性，又增加新的生物学功能，成为非病毒性基因载体材 料的天然高分子化合物。植物多糖免疫原性低，易于生物降解，其本身具有一定的生物学活 性。多糖单元结构中富含活性羟基，易于被活化而进行修饰。本专利技术选择植物多糖作为基本 骨架进行化学修饰后，使其成为一类非病毒型的基因载体。本专利技术提供的，总的专利技术构思是由生物学活性植物中提取 功能性多糖，经分离纯化明确分子量和生物学功能后，用特殊的试剂进行结构修饰，通过活 化糖基上的活泼羟基，连接小分子聚乙烯亚胺(PEI)，经透析冰冻干燥而获得的功能性植物 多糖。本专利技术提供的，包括如下步骤1)多糖提取与纯化从植物 原料中用水煮、乙醇沉淀方法提取粗多糖，用透析袋透析，再用葡聚糖凝胶柱分离，分离产物 用凝胶色谱法测定分子量分布，得到数均分子量在一定范围内的均一的生物学活性的植物多 糖；2)多糖结构修饰取纯化的多糖，溶解于磷酸盐缓冲液中；将活化羟基的连接剂溶解于二氯甲烷中，在氮气保护下，加入多糖溶液中，边加边搅拌，在90—120分钟内加完，加完 后在室温下反应60—90分钟，获得活化的多糖溶液；将小分子量聚乙烯亚胺，磷酸盐缓冲溶 液中，加入催化剂，避光、氮气保护、室温下加入到活化的多糖溶液中，边加边搅拌，120 一150分钟内加完，加完后避光、室温下反应120—150分钟，将反应完成的溶液经透析、冰 冻、干燥。获得多糖与小分子聚乙烯亚胺的聚合物的功能性植物多糖。 本专利技术所述的进行结构修饰的反应式如下<formula>formula see original document page 6</formula>反应式中n为多糖单元结构的个数，该数值直接反映了多糖分子量的大小。 反应式中m!反映了PEI中伯氨基单元的数量，ni2反映了仲氨基单元的数量，m,和m2的数 值与PEI的分子量有关。本专利技术所述的生物学活性的植物多糖为香菇多糖、黄芩多糖、灵芝多糖、米仁多糖、 仙人掌多糖、云芝多糖、枸杞多糖中任一种，分子量分布为10000-1100000。本专利技术所述的能活化羟基的连接剂为N，N'-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、 羰基咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基硫酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯中任一种。本专利技术所述小分子量聚乙烯亚胺的分子量为600、 1200、 2000的聚乙烯亚胺中任一种。本专利技术所述小分子量聚乙烯亚胺与磷酸盐缓冲液的重量体积比为20—50倍量。本专利技术所述的纯化的多糖与磷酸盐缓冲液的重量体积比为20—50倍量。 本专利技术所述的连接剂用量为纯化的多糖量重量比为1-2 : 3-5。 本专利技术所述的连接剂与二氯甲烷的重量体积比为25 — 50倍量。本专利技术所述的催化剂为三乙胺，用量与小分子量聚乙烯亚胺重量体积比为1-2:1-5倍本专利技术有益效果关于小分子量的聚乙烯亚胺结构说明，聚乙烯亚胺的结构如下:从结构中显示PEI具有3种不同的氨基形式，形成了不同的缓冲体系，氨基的存在基本 作用是结合DNA，扩展的功能是在携带DNA进入细胞时不同的氨基组合成不同的缓冲对，能 保护DNA免遭细胞质中的溶酶体降解。本专利技术功能性多糖用连接剂处理后，连接小分子的聚乙烯亚胺。功能性植物多糖具有一 定的生物学活性，所用的连接剂具有特殊的结构，能修饰多糖上的羟基，活化后连接的小分 子聚乙烯亚胺保留原先的的结构和功能。本专利技术以天然植物提取活性成分一多糖，在保留多糖原有活性基础上对其进行结构修饰， 该修饰方法优点在于简单高效，回收率高，经活化的羟基可以连接任何具有活性氢分子的化 合物，因此对多糖作用的扩展具有非常重要的意义。经活化糖基上的活泼羟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能性植物多糖的修饰方法，包括如下步骤：１）多糖提取与纯化：从生物学活性的植物原料中用水煮，乙醇沉淀方法提取粗多糖，用透析袋透析，再用葡聚糖凝胶柱分离，分离产物用凝胶色谱法测定分子量分布，得到数均分子量在一定范围内的均一的生物学活性的植物多糖；２）多糖结构修饰：取纯化的多糖，溶解于磷酸盐缓冲液中；将活化羟基的连接剂溶解于二氯甲烷中，在氮气保护下，加入多糖溶液中，边加边搅拌，在９０－１２０分钟内加完，加完后在室温下反应６０－９０分钟，获得活化的多糖溶液；将小分子量聚乙烯亚胺溶解于磷酸盐缓冲溶液中，加入三乙胺作为催化剂，避光、氮气保护、室温下加入到活化的多糖溶液中，边加边搅拌，１２０－１５０分钟内加完，加完后避光、室温下反应１２０－１５０分钟，将反应完成的溶液经透析、冰冻、干燥、获得多糖与小分子聚乙烯亚胺的聚合物的功能性植物多糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汤谷平，周峻，姜启英，胡秀荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]