一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法技术

本发明专利技术公开一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法。该方法增加了去多糖处理步骤，将高山杜鹃干叶用液氮研磨成粉末后加入1mL Buffer I后通过冰浴、离心、洗去植物细胞匀浆中大部分的多糖和多酚等次生代谢物质；细胞裂解液为4×CTAB；在DNA抽提中不直接对细胞裂解混合液进行抽提，而是对细胞裂解混合液经高速离心后分离得到的上清液进行抽提；在第一次抽提所得的上清液中加入Rnase A试剂室温处理20min，然后再进行第二次常规抽提；在DNA沉淀的洗涤中每次洗涤对换离心管的放置方向，且增加高速离心时间至5min。本发明专利技术方法得率高、纯度高、重复性好，可直接应用于下游的分子生物学实验。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)材料研磨取100mg高山杜鹃干叶置于提前加入液氮的研钵中研磨成粉末；(2)去多糖处理将粉末转移至装有1mL Buffer I的离心管中，置于冰上冰浴10min，期间不时摇匀，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清；如果上清液粘稠，再加入1mL Buffer I重复冰浴1次，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清，所述Buffer I含200mmol Tris‑HCl、50mmol EDTA、250mmol NaCl、1％β‑巯基乙醇(v/v)和1％PVP(m/v)；(3)CTAB提取液萃取在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热的4×CTAB裂解液800μL，然后置于65℃的水浴锅中水浴40min，期间不时摇匀，水浴结束后，于室温12000rpm离心8min，取上清液至新的离心管；(4)DNA抽提①第一次抽提：在步骤(3)所得的上清液中加入该上清液体积的1/2体积的pH>7.8Tris饱和酚，涡旋混匀后静置5min，再加入步骤(3)所得上清液体积的1/2体积的氯仿‑异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min，转移上清至新的离心管；②第二次抽提：在步骤(4)①抽提所得的上清液中加入10mg/mL Rnase A 5μL，于室温静止处理20min，再加入与步骤(4)①第一次抽提所得上清液等体积的氯仿‑异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min；步骤(4)①和步骤(4)②抽提步骤中所述的氯仿‑异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；(5)DNA沉淀将步骤(4)②第二次抽提所得上清液转移至新的离心管，然后加入步骤(4)②第二次抽提所得上清液体积的2/3体积的异丙醇混匀，－20℃沉淀1h后，于12000rpm，4℃离心8min，倒掉上清液得DNA沉淀；(6)DNA沉淀的洗涤和溶解①第一次洗涤DNA沉淀，在步骤(5)所得的DNA沉淀中加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，离心后倒置离心管控干酒精；②第二次洗涤DNA沉淀和DNA沉淀的溶解，加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，此次离心管的放置方向应与步骤(6)①第一次洗涤DNA沉淀时的离心管的放置方向相反，离心后倒置离心管控干酒精后，置于通风橱内晾干，最后加100μL ddH2O室温溶解得DNA溶液，DNA溶液经琼脂糖凝胶或NanoDrop仪检测后，置于－20℃下保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张露，李世峰，蔡艳飞，解玮佳，宋杰，彭绿春，李树发，陆琳，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53