具有木糖异构酶活性的嵌合多肽制造技术

本发明专利技术提供了能够将木糖转化为木酮糖的嵌合多肽，表达该嵌合多肽的工程化宿主细胞，构建该嵌合多肽的方法，以及发酵纤维素生物质以生产包括乙醇的生物燃料的方法。

Chimeric polypeptide with xylose isomerase activity

The present invention provides a chimeric polypeptide to convert xylose to xylulose, expression of engineered host cells the chimeric polypeptide and method of constructing the chimeric polypeptide, and fermentation of cellulosic biomass to ethanol production methods including biofuels.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有木糖异构酶活性的嵌合多肽联邦资助的研究或开发根据合同DE-PS02-06ER64304，本专利技术部分由生物能源科学中心(theBioenergyScienceCenter)橡树岭国家实验室(OakRidgeNationalLaboratory)—由生物和环境研究办公室(theOfficeofBiologicalandEnvironmentalResearch)支持的美国能源部(U.S.DepartmentofEnergy)的生物能源研究中心(BioenergyResearchCenter)资助。政府对本专利技术享有一定的权利。专利
总的来说，本专利技术的领域涉及能够将木糖转化为木酮糖的嵌合多肽，表达该嵌合多肽的工程化宿主细胞，构建嵌合多肽的方法，以及发酵纤维素生物质以生产包括乙醇的生物燃料的方法。专利技术背景酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是在由诸如玉米、甘蔗和甜菜的糖基底物商业化生产“第一代”燃料乙醇中使用的主要生物催化剂。第二代乙醇生产，也称为纤维素乙醇生产，使碳水化合物来源扩展到更复杂的多糖，如纤维素和半纤维素，其占大多数植物细胞壁的很大一部分，因此占大多数植物材料的很大一部分。商业上考虑的用于第二代乙醇生产的原料包括木材，农业残渣如玉米秸秆和小麦秸秆，甘蔗渣和有目的种植的材料(purposegrownmaterial)如柳枝稷。纤维素和半纤维素必须水解成单体糖，然后使用机械/化学手段和/或酶水解发酵。释放的单体糖包括葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖，而在大多数原料中，葡萄糖和木糖占单体糖的75％以上。为了使纤维素乙醇生产在经济上可行并与第一代乙醇竞争，生物催化剂必须能够使大多数(如果不是全部)的可用糖转化为乙醇。由于酿酒酵母的耐用性、高产率和多年的安全使用，其为用于第一代乙醇生产的优选生物。然而，天然存在的酿酒酵母不能将木糖发酵为乙醇。为了使酿酒酵母成为用于第二代乙醇生产的可行的生物催化剂，其必须能够发酵木糖。已经证明了在酿酒酵母中有两种木糖发酵的代谢途径。所述途径的主要差异在于木糖向木酮糖的转化。在第一种途径XR-XDH途径中，木糖还原酶(XR)将木糖转化为木糖醇，其随后由木糖醇脱氢酶(XDH)转化为木酮糖。迄今为止，所测试的XR和XDH酶对所需要的辅因子不同，NADH和NADPH，导致难以实现氧化还原平衡。第二种通常尝试的途径使用木糖异构酶(XI)使木糖直接转化为木酮糖，不需要氧化还原辅因子。来自细菌和真菌系统的XI已经成功地用于酿酒酵母中。两种途径均利用相同的下游代谢工程化：上调天然木酮糖激酶(XKS1)和戊糖磷酸途径的四种基因，具体是核酮糖-磷酸3-差向异构酶(RPE1)、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶(RKI1)、转醛醇酶(TAL1)和转酮醇酶(TKL1)(图1)。使用XI途径还通常需要删除天然醛糖还原酶基因(GRE3)以消除由于木糖醇形成引起的产物损失。专利技术简述本专利技术的方面涉及能够将木糖直接转化为木酮糖的新的嵌合多肽，并且本文描述了其构建和使用方法。在一些实施方案中，本专利技术涉及表达一种或多种嵌合多肽的宿主细胞。在本专利技术的一些实施方案中，嵌合多肽与SEQIDNO:1、3、5、7和/或9中任一条具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:1、3、5、7或9的氨基酸序列。在本专利技术的一些实施方案中，嵌合多肽与SEQIDNO:25具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:25的氨基酸序列。在本专利技术的一些实施方案中，嵌合多肽与SEQIDNO:27具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽由与SEQIDNO:2、4、6、8和/或10中任一条具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:2、4、6、8或10的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含在载体中。在一些实施方案中，嵌合多肽由与SEQIDNO:26具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:26的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含在载体中。在一些实施方案中，嵌合多肽由与SEQIDNO:28具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:28的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含在载体中。在本专利技术的一些方面，通过组合两个或多个来自现有的XI的片段构建嵌合多肽。在一些实施方案中，从来自如多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、软弱贫养菌(Abiotrophiadefectiva)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、松噬几丁质菌(Chitinophagapinensis)、Cyllamycesaberensis、瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)和/或相关细菌的核苷酸序列分离供体XI序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是经密码子优化的，例如，用于在酵母中表达。在一些实施方案中，一条或多条供体XI序列具有与SEQIDNO:12、14、16、18、20、22或24中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其包含与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、25和27的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.11 US 62/0357521.一种多肽，其包含与选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、25和27的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。2.一种多肽，所述多肽包含C-末端区域和N-末端区域，其中所述多肽的C-末端区域包含至少5个来自SEQIDNO:13的氨基酸序列的连续氨基酸，并且所述多肽的N-末端区域包含至少5个来自选自SEQIDNO:11、15、17、23或其组合的氨基酸序列的连续氨基酸。3.权利要求2所述的多肽，其中所述多肽的N-末端区域包含至少5个来自选自SEQIDNO:11、23及其组合的氨基酸序列的连续氨基酸。4.权利要求2所述的多肽，其中所述多肽的N-末端区域包含至少5个来自选自SEQIDNO:11、17、15及其组合的氨基酸序列的连续氨基酸。5.一种多肽，其包含C-末端区域和N-末端区域，其中所述C-末端区域包含至少5个来自SEQIDNO:15的氨基酸序列的连续氨基酸，并且所述N-末端区域包含至少5个来自选自SEQIDNO:19、21、23及其组合的氨基酸序列的连续氨基酸。6.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含：a.存在于188-196位的氨基酸VXW[GP]GREG[YSTA]，其中“X”为任何氨基酸，并且其中括号中的氨基酸表示带括号的氨基酸之一可以存在于该位置；b.存在于233-240位的氨基酸[LIVM]EPKPX[EQ]P，其中“X”可以是任何氨基酸，并且其中括号中的氨基酸表示带括号的氨基酸之一可以存在于该位置；和c.在103位的His残基，在106位的Asp残基和在341位的Asp残基；其中所述位置是指参考SEQIDNO:11的氨基酸序列中的位置。7.一种多核苷酸，其具有编码权利要求1-6中任一项所述的氨基酸序列的核苷酸序列。8.权利要求7所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列经密码子优化。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·弗勒利希，B·汉宁森，
申请(专利权)人：拉勒曼德匈牙利流动管理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：匈牙利,HU