硫-35标记单克隆抗体及其制备方法技术

一种硫－３５标记的单克隆抗体ＳＺ３９（↑［３５］Ｓ－ＭｃＡｂ－ＳＺ３９）是放射性↑［３５］Ｓ标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体ＳＺ３９的交联物。其制备方法分二步进行，首先Ｈ↓［２］↑［３５］ＳＯ↓［４］与苯胺合成↑［３５］Ｓ－对氨基苯磺酸，然后用碳二亚胺法由↑［３５］Ｓ－对氨基苯磺酸与ＭｃＡｂ－ＳＺ３９交联而成。↑［３５］Ｓ－ＭｃＡｂ－ＳＺ３９能良好地保持单抗的免疫活性，并具有与人脑胶质瘤特异结合的特性，对肿瘤细胞杀伤力强，而对正常细胞组织及周围人员无损伤，因此应用于制备放射性导向治疗人脑胶质瘤的医药制品有良好的前景。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有放射性核素标记的单克隆抗体，尤其是关于一种核素35S标记单克隆抗体及其制备方法。脑胶质瘤为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其病例占脑肿瘤的50％左右，它的特点是肿瘤中约30％的细胞参与增殖，70％的细胞虽然不参与增殖活动，但具有增殖力，需要时即可转入增殖群，细胞周期时间约2-3天。脑胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤边缘常是正常细胞和肿瘤细胞交织存在的场所，依然存在血脑屏障，致使许多化疗药物不能到达。脑胶质瘤患者的死亡率和手术复发率高，是恶性度较高的肿瘤。放射治疗会在射线杀伤肿瘤的同时杀伤正常细胞。有文献报道在60Gy照射剂量时病人生存时间有增加，但在70-80Gy照射剂量时有可能超过脑的最大耐受量，使生存率反而下降。现在采用γ刀技术，虽然大大改善了射线的剂量分布，但只能是改善。总之，由于脑胶质瘤为恶性肿瘤，病人复发率和死亡率都很高。世界各国均在寻找更好的治疗方法。自从1975年应用细胞杂交技术生产单克隆抗体的研究成功以来，应用单抗来研究肿瘤相关抗原，使肿瘤免疫学研究出现了新的飞跃，用放射性核素标记单克隆抗体作为治疗脑肿瘤有较好的前景。碘-131标记单克隆抗体首先被研究(Zanintaky MR，et al.Cancer Res.1989；492807)。后来又公布了碘-131标记单克隆抗体SZ39(Yang W.L.，et al ChineseMed. J.1988；101(12)919)。但由于I-131的γ射线和β射线的能量较高，使医护人员和病人正常组织受到较大的损伤，同时由于体内脱卤酶的存在和作用，使I-131容易从单克隆抗体上脱落下来，非但使药物失效并因I-131浓集在甲状腺造成危害。因此，碘-131标记的单克隆抗体不能作为治疗药物推广使用。近年来，国际上趋向采用发射α和β粒子的放射性核素进行导向放疗。R.G.Fairchild等报道(R. G.Fairchild et al，Radiation Oncology Biol.Phys.，1989；17(2)337-343)以35S标记硫氧嘧啶治疗黑色素瘤荷瘤鼠，治疗量为48.1-370MBq，小剂量可产生抑瘤效果，大剂量可使肿瘤消退。另据报道(G.R.Gottschalk et al，Cancer Res.1959；191070)，20.7-34.3 GBq Na235SO4治疗病人未引起放射性疾病，仅有可逆性白细胞减少。可见从射线杀伤力及安全性考虑，35S有希望应用于导向放疗。为此，采用单克隆抗体为导向物，将35S标记引入到肿瘤部位，即对S-35标记的单克隆抗体及其应用于制备治疗脑胶质瘤的医药制品，是一个很有意义的科研工作。本专利技术目的是提供一种35S标记单克隆抗体SZ39，它能良好地保持单克隆抗体的免疫活性，并能与人脑胶质瘤细胞特异结合，其35S标记物放射化学纯度可达99％，放射性比活度可高达51.8MBq/mg，能有效地杀伤肿瘤细胞。本专利技术另一目的是提供35S标记单克隆抗体SZ39的制备方法，该方法首先用硫-35标记的硫酸与苯胺合成35S-对氨基苯磺酸，然后用硫-35标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39进行交联而成35S-对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物。本专利技术又一目的是提供35S标记单克隆抗体SZ39可应用于制备治疗人脑胶质瘤的医药制品。本专利技术是一种硫-35标记单克隆抗体SZ39(35S-McAb-SZ39)，它是由35S-对氨基苯磺酸和单克隆抗体SZ39交联而成的放射性标记的35S-对氨基苯磺酸与单克隆抗体SZ39的交联物。McAb-SZ39属于IgG2亚类，重链分子量为55KD，免疫转移电泳证实，McAb-SZ39抗体识别抗原为胶瘤细胞膜上MW180000的糖蛋白(参见杨伟廉，中华神经外科杂志1988；4(4)234)，该单抗效介较高，经1∶10000稀释后，ELISA测定对靶细胞仍呈强阳性反应。免疫组化、免疫荧光及ELISA法测定结果显示，McAb-SZ39绝大多数胶质瘤细胞系和颅内恶生胶质瘤呈强结合反应，而与其它被检测肿瘤及肿瘤细胞系无反应。组织特异性测定显示McAb-SZ39与正常淋巴细胞，ABO型红细胞、白细胞、血小板骨髓细胞、皮肤成纤维细胞及肝、脾、肺、胰、子宫、胃、食道、大脑、小脑、皮肤、横纹肌等12种正常人体细胞组织均无反应，由此可见，McAc-SZ39对人脑胶质瘤能特异结合。35S标记的单克隆抗体SZ39，既保持了McAb-SZ39与人脑胶质瘤结合的特异性，又有35S核素发射纯β射线线性能量转移高的特点，35S发射的β粒子最大能量为0.167Mev，组织中最大射程为300μm，约为30个细胞直径的杀伤范围。对肿瘤细胞杀伤力强，而对正常细胞组织及周围人员无损害。在对荷人胶质瘤裸小鼠的实验中，证实其对肿瘤的生长抑制率在用药5天后就高达30％以上。因此，35S标记McAb-SZ39用于制备放射性导向治疗人脑胶质瘤的医药制品有着良好的应用前景。本专利技术硫-35标记单克隆抗体SZ39的制备方法以H235SO4为初始物质的核素硫-35标记McAb-SZ39路线示意图如下 制备方法分二步进行一、35S-对氨基苯磺酸的制备将H235SO4加入苯胺中，再加入H2SO4作为载体进行反应，H235SO4加入量极微，对苯胺而言可以忽略，苯胺与H2SO4的克分子比例为1∶1-4，反应温度175-185℃，反应时间38-60小时。反应得粗产物用板层析分离，得35S-对氨基苯磺酸Rf值为0.36，35S-苯氨硫酸盐Rf值为0。放射生板层析扫描图(图1)显示35S-苯氨硫酸盐转换成35S-对氨基苯磺酸的转换率。将制得的35S-对氨基苯磺酸与对氨基苯磺酸标准品在紫外分光光度计上测定光谱图，证实两者光谱图相一致(见图2)。二、硫-35标记单克隆抗体SZ39的制备采用碳二亚胺(CDC)法将35S-对氨基苯磺酸与单抗SZ39交联成35S标记McAb-SZ39交联物。将上面制得的35S-对氨基苯磺酸加入到单抗SZ39和碳二亚胺的磷酸缓冲液(PH＝7.4)中进行交联反应。35S-对氨基苯磺酸与单抗SZ39的克分子比例为1∶1.2，单抗SZ39与CDC的重量比为1∶10，在12-25℃温度范围内搅拌反应，时间15-45分钟，标记单抗反应完毕后，装透析袋对蒸馏水透析。然后用液体闪烁谱仪测定放射性强度，根据放射性投料量计算出放射化学产率。根据单抗的化学量计算出35S标记McAb-SZ39的放射性比活度。并用高压液相色谱鉴定35S标记单克隆抗体的放射化学纯度，用ELISA方法检测35S标记单克隆抗体SZ39的免疫活性，它稀释至1∶10000仍呈阳性。碳二亚胺法方法简便，只要调节好反应液中单抗SZ39和碳二亚胺一定比例，反应就能很好进行，由于反应在温和条件下进行，又无需调节PH，使单抗活性不受PH变化影响，且免疫活性保持时间长，在二周内无变化。本专利技术35S标记单抗SZ39在裸鼠体内进行治疗的实验。以荷瘤裸小鼠为模型，即将人脑胶质瘤NHG-1皮下移植裸小鼠为模型，给药方法均为腹腔注射，103.6MBq/只小鼠，实验分三组进行1)35S-McAb-SZ39治疗组；2)35S-IgG治疗组；3)空白对照组。在裸小鼠接种后7天给药，连续观察肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硫－３５标记单克隆抗体ＳＺ３９，其特征在于它是由［３５］↑Ｓ－对氨基苯磺酸和属于ＩｇＧ↓［２］亚类并具有５５ＫＤ重链分子量的单克隆抗体ＳＺ３９交联而成的放射性［３５］↑Ｓ标记的对氨基苯磺酸与单克隆抗体ＳＺ３９的交联物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴元芳，周桢堂，张雨龙，庄道玲，要福增，
申请(专利权)人：中国科学院上海原子核研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]