蛋白酶缀合物制造技术

本发明专利技术涉及枯草杆菌蛋白酶缀合物，该缀合物包含一种蛋白酶部分和一种或多种附加部分，所述蛋白酶部分的氨基酸序列是对亲本氨基酸序列修饰后生成的序列，所述亲本氨基酸序列包含一个第一表位区域、一个第二表位区域以及一个第三表位区域，其中所述的修饰后氨基酸序列中包括用取代氨基酸在一个或多个上述表位区域中的一个或多个位置上进行的取代，其中所述的每个附加部分都与一个取代部分共价相连。本发明专利技术进一步还涉及包含此类蛋白酶缀合物的清洁及个人护理组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及枯草杆菌蛋白酶缀合物以及含有所述缀合物的组合物，与其对应亲本蛋白酶相比该缀合物免疫原性已减弱。清洗领域中，最常用的是丝氨酸蛋白酶。大多数丝氨酸蛋白酶是细菌生成的，而其中的一小部分是由其它微生物生成的，例如真菌。参见，Siezen等人，“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟及蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4,No.7,pp.719-737(1991)。不幸的是，野生型蛋白酶在其天然环境中的功效往往不能被转移到非天然清洗组合物的环境中。具体地说，蛋白酶特性，例如，热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性以及底物特异性等，在该蛋白酶天然环境之外都未必能达到最佳。现已用几种方法改变丝氨酸蛋白酶的野生型氨基酸序列，以增强蛋白酶在非天然洗涤环境中的功效。这些方法包括蛋白酶的遗传重构和/或化学修饰以增强蛋白酶在迥然不同条件下的热稳定性和氧化稳定性。但是，由于这类蛋白酶对于哺乳动物是异源性的，所以它们是潜在抗原。作为抗原，这些蛋白酶会引起哺乳动物的免疫原和/或变应原应答(本专利技术中统称为免疫原应答)。实际上，在人类经常接触丝氨酸蛋白酶的环境中已经观察到了对丝氨酸蛋白酶的致敏。这类环境包括生产车间，其中的工人通过未控制的粉尘或烟雾化接触到蛋白酶。烟雾化能够由蛋白酶导入肺而产生，这种接触蛋白酶的途径能够引发最危险的应答。蛋白酶致敏还发生于市场，其中消费者反复使用含有蛋白酶的产品可引发免疫应原答。另外，虽然在通过遗传重构和化学修饰开发用于洗涤的更高效蛋白酶的持续研究中已取得了显著的成效，但是这类蛋白酶几乎还未用于个人护理组合物和精细织品洗涤剂中。肥皂、凝胶、浴液以及香波等产品中不添加蛋白酶的主要原因是由于上述的人体致敏会导致不良的免疫原应答的问题。因此，提供一种具有蛋白酶的清洁性能但又使所激发的免疫原应答降至最小的个人护理组合物将具有十分重要的意义。目前，用下述方法可使对蛋白酶的免疫原应答减至最小将化学修饰后的蛋白酶固定、制粒、包被或溶解以避免其成为气载的。这些方法虽然考虑了消费者与气载蛋白酶的接触，但仍存在着与下述现象相关的危险与成品组合物的过度组织接触以及生产过程中工人与含蛋白酶粉尘或气溶胶的接触。在医药领域，已有人提议可通过另一方法减小酶的免疫原性。该方法涉及将聚合物与酶连接。参见，例如，1979年12月18日颁布的授予Davis等人的美国专利4,179,337和1996年6月13日公开的Olsen等人的PCT申请WO96/17929。减小蛋白酶免疫原活性的一种方法就是弱化表位的免疫原性。表位是抗原中的氨基酸区域，它们能够通过与抗体结合或者通过主要组织相容性复合物蛋白(MHC)将加工过的抗原提呈给T细胞来激发免疫应答。表位的变化能够影响它们作为抗原的功效。参见Walsh,B.J.和M.E.H.Howden，“在修饰表位图谱基础上检测变应原中IgE结合序列的方法”，免疫学方法杂志，Vol.121,pp.275-280(1989)。本专利技术人已经发现那些通常称为枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，包括枯草杆菌蛋白酶BPN’，在与枯草杆菌蛋白酶BPN’对应的第70-84、103-126和217-252位氨基酸上具有突出的表位区域。在本专利技术中，本专利技术人已对该枯草杆菌蛋白酶中的一个或多个表位区域进行了化学修饰，从而弱化了该蛋白酶的免疫原性。这样做，可将对蛋白酶活性位点的影响控制在最小。因此，本专利技术人已发现了能激发减弱后的免疫应答但仍保持它们作为有效和活性蛋白酶的活性的枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。因此，本专利技术所述的蛋白酶缀合物可以稳定地用于几种类型的组合物中，包括但不限于，洗衣、清洗餐具、清洗坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洗接触透镜的组合物。专利技术概述本专利技术涉及枯草杆菌蛋白酶缀合物，其中包括一个蛋白酶部分和一个或多个附加部分，其中(a)所述的蛋白酶部分的氨基酸序列是对亲本氨基酸序列修饰后生成的序列，所述亲本氨基酸序列包含一个第一表位区域、一个第二表位区域以及一个第三表位区域，其中所述的修饰后的氨基酸序列包括取代一个或多个表位区域中的一个或多个位置上的氨基酸，其中(ⅰ)当取代发生在第一表位区域中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶BPN’第70-84位对应的一个或多个位置上；(ⅱ)当取代发生在第二表位区域中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶BPN’第103-126位对应的一个或多个位置上；以及(ⅲ)当取代发生在第三表位区域中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶BPN’第217-252位对应的一个或多个位置上；以及(b)其中的每个附加部分都与所述蛋白酶部分上的一个取代氨基酸共价相连，并且具有下列结构 其中所述X不存在或为一连接部分；R1不存在或选自第一多肽和第一聚合物；R2不存在或选自第二多肽和第二聚合物；其中所述的X、R1和R2中至少有一个不不存在。本专利技术进一步还涉及含有这类蛋白酶缀合物的清洁及个人护理组合物。专利技术详述本专利技术的主要组分如下所述。另外还包括对用于本专利技术实施方案中的各种任选及优选组分的非限制性描述。本专利技术可以包括任意一种本专利技术所述的必需或任选组分和/或限度，或者由或基本由任意一种本专利技术所述的必需或任选组分和/或限度所组成。除另有说明外，所有百分比和比率都以重量来计算。除另有说明外，所有百分比都是根据组合物总量来计算的。所有组分或组成含量都以该组分或组成的活性物含量为参照，并且排除杂质，例如，可能存在于商业来源产品中的残留溶剂或副产物。本专利技术中所提及的所有文献，包括所有专利、专利申请以及印刷出版物均在此全文引入作为参考。本专利技术中使用商品名的物质包括，但不限于酶。本专利技术人在本专利技术中并不打算受到某一商品名物质的限制。某一商品名物质的等效物(例如，从不同来源得到的名称或目录(参考)号不同的物质)可以被代替并用于本专利技术所述的蛋白酶缀合物及组合物。本专利技术使用缩写来描述氨基酸。表1中提供了本专利技术使用的一系列缩写表Ⅰ氨基酸三字母缩写单字母缩写丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺 AsnN天冬氨酸 AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸 GluE甘氨酸 GlyG组氨酸 HisH异亮氨酸IleI亮氨酸 LeuL赖氨酸 LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸 ProP丝氨酸 SerS苏氨酸 ThrT色氨酸 TrpW酪氨酸 TyrY缬氨酸 ValV定义本专利技术使用的术语“突变”是指基因序列以及由该基因序列生成的氨基酸序列中的变化。突变包括野生型蛋白质序列中氨基酸残基的缺失、取代以及添加。本专利技术使用的术语“亲本”是指一种酶，野生型或变体。本专利技术使用的术语“野生型”是指未突变的生物所产生的蛋白质，例如蛋白酶或其它酶。本专利技术使用的术语“变体”是指这样的酶，即由于编码野生型酶的核苷酸序列中发生了遗传突变或者野生型酶本身发生突变生成的酶，其氨基酸序列不同于对应的野生型酶的氨基酸序列。本专利技术使用的所有聚合物分子量都用重量平均分子量来表示。本专利技术所述的缀合物不只限于那些含有枯草杆菌蛋白酶BPN’及其变体的缀合物，所有氨基酸编号方式均参照由SEQ ID NO:1表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的进一步描述见Wells等人，核酸研究，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白酶缀合物，其中包含一种蛋白酶部分以及一种或多种附加部分，其中：（ａ）所述蛋白酶部分的氨基酸序列是对亲本氨基酸序列修饰后生成的序列，所述亲本氨基酸序列包含一个第一表位区域、一个第二表位区域以及一个第三表位区域，其中所述的修饰后氨基 酸序列中包括用取代氨基酸在一个或多个上述表位区域中的一个或多个位置上进行的取代，其中：（ｉ） 当取代发生在第一表位区域中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶ＢＰＮ’第７０－８４位对应的一个或多个位置上；（ｉｉ） 当取代发生在第二表位区域 中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶ＢＰＮ’第１０３－１２６位对应的一个或多个位置上；以及（ｉｉｉ） 当取代发生在第三表位区域中时，该取代出现在与枯草杆菌蛋白酶ＢＰＮ’第２１７－２５２位对应的一个或多个位置上；以及（ｂ） 其中的每个附 加部分都与所述蛋白酶部分上的一个取代氨基酸共价相连，并且具有下列结构：＊＊＊其中所述的Ｘ不存在或为一连接部分；Ｒ１不存在或选自第一多肽和第一聚合物；Ｒ２不存在或选自第二多肽和第二聚合物；其中所述的Ｘ、Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］中至少有一 个不不存在。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJ威斯博格，DN鲁宾格，PE考瑞尔，
申请(专利权)人：宝洁公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]