本发明专利技术通过噬菌体展示技术分离了一种ＨＥＲ－２模拟抗原表位小肽（通式Ⅰ）。本发明专利技术还对该表位小肽进行了突变修饰，鉴定了几种仍然保持免疫原性的这种抗原表位的衍生物。含有这种表位或其衍生物的肽或肽与其它蛋白的融合可以用作疫苗用于诱导产生针对ＨＥＲ－２的体液和细胞免疫反应，进而发挥对肿瘤的预防及治疗作用。本发明专利技术还合成了编码这些肽的寡核苷酸、构建了含有该寡核苷酸或该寡核苷酸与编码其它蛋白基因重组的表达载体并转化细胞。本发明专利技术提供了一种寡核苷酸、载体或细胞可以治疗肿瘤的方法和药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及针对HER-2的主动免疫的诱导和增强，具体地，本专利技术涉及一种通过噬菌体展示技术分离的HER-2模拟抗原表位模拟肽及经过修饰，但仍然保持免疫原性的这种抗原表位肽的衍生物。本专利技术还涉及含有这种表位肽或其衍生物的疫苗。该疫苗通过诱导产生针对HER-2的体液和细胞免疫反应而用于对肿瘤的预防和治疗。本专利技术还涉及编码这些肽的核苷酸、核苷酸与其它分子的重组融合蛋白、含有该核苷酸的载体和细胞，以及利用这些肽、核酸、或细胞治疗肿瘤的方法和药物组合物。
技术介绍
HER-2受体属于表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)家族成员。在结构上，它包括糖基化的胞外区，水化穿膜区和胞内酪氨酸激酶区。目前尚未发现HER-2的配体。在以EGFR家族为起始的信号通路中，HER-2发挥了重要的调节作用。HER-2是通过与EGFR，ErbB-3，ErbB-4形成异源二聚体而发挥作用的。异源二聚体可与EGF样配体形成高亲和力结合，同时激活下游多种信号通路。原癌基因HER-2/c-erbB2/neu在多种恶性肿瘤中有基因扩增及过表达，特别是在乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、结肠癌中其表达水平升高更为明显。HER2过表达与癌症患者预后不良、易复发、存活率低有关。近十年来，HER-2被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶点之一。这不仅是因为HER-2的过表达见于多种人类肿瘤，而且其过表达与恶性肿瘤(如乳腺癌)预后不良有关。此外，在正常成人组织HER-2表达很低，而在肿瘤原发灶和转移灶中均有HER-2的稳定表达。因此抗HER-2免疫治疗可产生针对肿瘤的特异性疗效。在被动免疫治疗中，人们获得了多种针对HER-2胞外区的单克隆抗体，一些抗体可抑制肿瘤生长。其中一株抗体——Herceptin(Trastuzumab)目前已经过临床评估，并于1998年9月被美国FDA批准用于临床治疗。Herceptin是第一个用于乳腺癌治疗的生物学制剂，它可单独用药或与化疗药联合应用。由于Herceptin的价格昂贵，用药量大，需反复多次使用，致使一般病人在经济上难以承受。除了上述被动免疫治疗，使病人产生针对HER-2的主动免疫反应也是有效的免疫治疗方法。HER-2作为潜在的肿瘤疫苗具有许多优势。首先，一些HER-2表达阳性的肿瘤病人体内有针对HER-2的免疫反应，这就提示机体可以克服针对自身蛋白的免疫耐受。其次，由于HER-2在肿瘤细胞过表达，而在正常组织低表达，使得病人产生的针对HER-2的免疫反应具有肿瘤组织特异性，而对正常组织毒性很小或没有毒性。最后，HER-2作为一个重要的生长因子受体，病人体内产生的针对HER-2的体液免疫反应可通过多种机制诱导肿瘤细胞死亡。Pupa等人于1993年首次报道，HER-2过表达的乳腺癌患者体内存在针对HER-2的血清抗体和T细胞反应。此外，其它报道也证明乳腺癌患者体内存在针对HER-2的内源性体液和细胞免疫反应。Disis等人研究发现在127个乳腺癌患者中，14人(11％)血清抗HER-2抗体滴度大于1∶100，而100个正常女性中无一例检测到抗HER-2抗体。特别是其中处于乳腺癌早期的5名患者体内存在强烈的体液免疫反应，血清抗体滴度大于1∶5000。血清中高滴度抗HER-2抗体的出现与早期原发癌HER-2过表达相关。而在晚期乳腺癌患者没有发现这种相关性，病人血清中可检测到HER-2胞外区蛋白(ECD)，但其体内的抗体检出率明显低于早期肿瘤患者。结肠癌患者血清中也可检测到抗HER-2抗体。此外，在不同类型上皮恶性肿瘤患者体内可检测到针对所有EGFR受体的抗体反应。针对HER-2的辅助性T细胞免疫反应一般可与抗HER-2抗体一起检测到。血清中的抗HER-2抗体主要是IgG或IgA，抗体从IgM到IgG或IgA的转型反应需要T细胞的辅助作用，这一过程需要HER-2含有辅助性T细胞表位。潜在的辅助性T细胞表位一般是通过计算机程序算法(computer algorithms)选择的。通过合成这些表位相对应的肽并检测它们诱导产生细胞因子或刺激外周血淋巴细胞增殖的能力来评估小肽的活性。Kobayashi等人研究发现了一系列具有HLA-DR结合特性的辅助性T细胞表位。其中一个肽在体外可诱导HER-2特异的HLA-DR限制型辅助性T细胞反应。此外，小肽激活的辅助性T细胞可识别抗原递呈细胞表面天然递呈的HER-2蛋白。在HER-2过表达的肿瘤病人体内还可检测到HER-2反应性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)。这些CTL细胞可在体外被分离培养，通过用自身固有的肿瘤细胞进行刺激，CTL细胞得到扩增。由于诱导HER-2特异性CTL细胞需要小肽的递呈和在细胞表面的暴露，目前已发现一些HLA种型限制性HER-2CTL小肽表位。这些肽段具有结合特定HLA种型的同源序列。这些潜在的CTL表位可激发树突状细胞，并进一步产生CTL细胞，这些CTL细胞可裂解HER-2转染的永生化细胞或自身固有的肿瘤细胞。表1详细列出了目前已发现的HER-2CTL表位和辅助性T细胞表位。HER-2特异性CTL细胞可裂解自身固有的肿瘤细胞，这一作用提示多种HER-2来源的表位可通过天然递呈作用暴露在细胞表面。实际上，通过用酸性洗脱液洗涤肿瘤细胞，可得到肿瘤细胞表面HLA-I类分子上暴露的HER-2抗原肽。一些肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾细胞癌和结肠癌，都可检测到HER-2CTL表位表达。此外，一些完全不同类型的上皮性肿瘤拥有相同的HER-2CTL表位。总之，这些研究提示HER-2不仅可被呈递在肿瘤细胞表面，还可引起肿瘤患者的体液和细胞免疫反应。在发现病人体内免疫反应的同时，人们提出了一个重要问题这种免疫反应是否具有抗肿瘤作用？一些研究提示病人体内的免疫反应是有益的。针对1000例以上乳腺癌患者的研究发现，在原发癌有淋巴浆细胞浸润(Lymphoplasmacytic Infiltration，LPI)的I期病人，HER-2过表达提示有较好的预后。最近的研究发现，同是淋巴结未受肿瘤侵袭的病人，如果没有LPI反应，HER-2过表达提示预后不良；而具有LPI的病人则预后较好。在原发乳腺癌肿瘤内部可检测到T细胞，但并没有检测到HER-2过表达，这是因为在HLA-A2阳性的乳腺癌患者，宿主的免疫反应可去除HER-2过表达的肿瘤细胞，因此HER-2检测呈阴性反应。这些发现均提示在肿瘤发生早期，免疫反应可延缓肿瘤发展进程。表1 HER-2的辅助性T细胞(helper T cell)表位和细胞毒T细胞(cytotoxic T cell)表位 数字代表HER-2蛋白的氨基酸所在位置；N/A代表未进行评估。然而，目前的研究结果只反应了小部分病人的免疫反应情况。自身固有的T细胞和特异性抗体反应是否真正有益，还需要大量流行病学研究和长时间的随访来验证。病人体内抗HER-2免疫反应的存在提示疫苗可诱导并增强针对HER-2的免疫反应。近几年，许多动物模型均证实疫苗可引起针对HER-2的免疫反应。应用于动物体内的抗HER-2疫苗被证明具有免疫原性，而且是安全有效的。肿瘤疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
以正向或反向连续地或间隔地包含多个或只包含一个以下通式（Ⅰ）所示的氨基酸序列的肽：Ｘ９Ｘ１Ｘ２ＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＨＸ１０，（Ⅰ）其中，Ｘ１可以存在或不存在，为天然的氨基酸残基，Ｘ２可以存在或不存在，为疏水 性氨基酸残基，Ｘ３为极性氨基酸，Ｘ４为极性氨基酸，Ｘ５为疏水性氨基酸，Ｘ６为极性氨基酸Ｘ７为极性氨基酸，可以与Ｘ４相同或不同，Ｘ８为疏水性氨基酸，可以与Ｘ５相同或不同，其中，Ｘ９和Ｘ１ ０为天然氨基酸，可以存在或不存在，式（Ⅰ）的肽可以是线形的或环化的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：寿成超，姜北海，
申请(专利权)人：北京市肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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