分析蛋白的抗原表位的方法技术

本发明专利技术公开了一种分析蛋白的抗原表位的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：（１）构建目的蛋白的ＤＮＡ文库；蛋白的编码基因的ＤＮＡ片段插入Ｔ载体；Ｔ载体含酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的编码基因，ＤＮＡ片段编码的肽段与酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的Ｃ端融合；（２）将ＤＮＡ文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；（３）分选出与目的蛋白的抗体结合的酵母；（４）提取质粒测序，分析蛋白的抗原表位。本发明专利技术具如下优点：（１）酵母细胞对蛋白的修饰途径多，可方便地展示大分子量和复杂的蛋白，更好的模拟空间构象；（２）酵母可采用ＦＡＣＳ逐个筛选，提高准确性与筛选通量；（３）酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；（４）酵母不易被空气传播，不易交叉感染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。技术背景宿主的抗体反应在抵抗病原体感染的过程中起着重要作用，而体内的多克隆抗 体反应是由针对不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体组成的。深入的理解 这个复杂的过程能够为研究疾病的发病机制提供关键的信息，还能够为高效疫苗的研发 和疾病治疗提供重要的理论基础。在抗原表位的诸多研究方法中，兴起于1990年的噬菌体展示肽库技术 (Scott, J.K.and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library.Science,1990.249 (4967) p.386-90.),即用随机合成的短肽文库(一般6_12个氨基酸，库容量达 IOll-IO12)和噬菌体展示系统进行筛选的方法，以其快捷、准确、不受氨基酸位点限制的 优点而逐渐成为目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。然而，噬菌体展示 肽库技术也存在很大的局限性(1)短肽文库可以产生的绝大部分是线性表位，不能很 好地模拟占抗原表位80%以上的构象型表位；(2)噬菌体的衣壳蛋白所能容纳的外源分 子小、结构简单，对外源蛋白缺乏修饰，该系统中很多细胞毒性分子和真核生物蛋白难 以表达和展示；( 噬菌体个体过小，多采用亲合层析柱或亲合聚苯乙烯板进行筛选， 筛选效率低；(4)每轮筛选后，噬菌体必须重新感染宿主细胞以便获得足够的病毒粒子 进行下一轮筛选，重组病毒粒子间感染能力的差别会造成一定的扩增优势；( 噬菌体 易被空气传播，因而容易引起交叉污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。本专利技术提供的，包括如下步骤(1)构建目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA 片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核 苷酸序列分析蛋白的抗原表位(包括线型表位和构象型表位)。所述T载体为在PCTC0N2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列 表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T质粒；所述目的蛋 白的DNA片段插入所述pCTC0N2-T质粒的Xcm I酶切位点。所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。所述方法中，可利用流式细胞术(FACS)进行步骤(3)中的所述分选。3步骤O)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤①提取所述DNA文库的质粒转化所述酵母，得到重组酵母；②收集重组酵母诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库；所述诱导是通过向 培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培 养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素相， NaHPO4 · 12H20 13.6g, NaH2PO4 · H2O 8.56g,加重蒸水至 1L。构建所述DNA文库的方法包括如下步骤(1)将目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50_100bp的DNA片段；(2)将步骤(1)回收的DNA片段进行随机片段重组；(3)将步骤⑵重组后的DNA片段加A尾；(4)将加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2_T质粒的Xcm I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。所述随机片段重组的反应体系具体可为90ng小片段DNA，4μ1 5XPhire buffer, 0.8 μ 1 dNTPs, 0.5 μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 个单位)，力卩 ddH20 至 20 μ 1。所述随机片段重组的反应程序具体可为95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟， 10个循环或15个循环；72°C 10分钟；第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开始， 每个循环比上个循环N增加k (即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒， 以此类推)。所述反应程序中，优选10个循环或15个循环。也可用物理剪切法、随机引物扩增法和酶消化法等方法构建目标蛋白的DNA文库。所述目的蛋白的抗体可为多克隆抗体(如商购的多克隆抗体或用目的蛋白免疫 动物得到的多克隆抗体)或单克隆抗体。所述宿主菌可为大肠杆菌，优选大肠杆菌DH5a。所述目的蛋白可为序列表的序列1所示的蛋白(H5N1禽流感病毒的HA蛋白)。 所述目的蛋白的编码基因优选序列表的序列2所示的DNA。本专利技术还保护pCTCON2-T质粒，是在pCTCON2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的。本专利技术还保护-种酵母表面展示系统，包括所述pCTCON2-T质粒和酵母。所述酵母可为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。上述方法基于如下原理信号肽引导外源多肽向细胞外分泌，外源多肽片段的 N端与酵母a凝集素Aga2p的C端融合(320个氨基酸残基，含有GPI锚的信号序列)， 可通过Aga2p锚定到酵母表面的Agalp受体，从而暴露在酵母细胞表面。与噬菌体展示相比，酵母表面展示系统在构建和筛选蛋白文库方面具有独到的 优点(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径更多，可以方便地展示大分子量和复杂的蛋白， 以更好的模拟空间构象；( 酵母可采用FACS逐个筛选，大大提高准确性与筛选通量； (3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母不易被空气 传播，不易交叉感染。附图说明图1为表面展示HA、HAU HA2的酵母的流式检测结果。图2为荧光显微镜下观察HA在重组酵母甲表面展示的情况。图3为H5N1-HA蛋白的抗原表位的分析流程图。图4为构建H5N1-HA蛋白的DNA文库过程中的1 %琼脂糖凝胶电泳图。图5为FACS分选前后的FACS分析结果(富集效果)。图6为分选得到的部分单个酵母克隆的FACS检测结果。图7为序列比对结果。图8为频率统计结果。图9为血清优势识别区域。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。FACS分析和分选采用AriaII流式细胞仪进行。 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pCTCON2质粒(酵母展示载体)由MIT Dane Wittrup教授惠赠，公众可以从清 华大学获得；参考文献Chao, G.，etal.，Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display.NATURE PROTOCOLS, 2006.1(2) p.755-768)。酿酒酵母EBYlOO invitrogen公司，产品目录号C839-00。Biomed质粒小提 试剂盒博迈德公司。大肠杆菌DH5 α本文档来自技高网...

【技术保护点】
分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤：（１）构建目的蛋白的ＤＮＡ文库；所述ＤＮＡ文库中，所述目的蛋白的编码基因的ＤＮＡ片段插入Ｔ载体；所述Ｔ载体含有酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的编码基因，且所述ＤＮＡ片段编码的肽片段的Ｎ端与所述酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的Ｃ端融合；（２）将所述ＤＮＡ文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；（３）将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；（４）将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述Ｔ载体的ＤＮＡ片段的核苷酸序列分析蛋白的抗原表位。

【技术特征摘要】
1.分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤(1)构建目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA 片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸 序列分析蛋白的抗原表位。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述T载体为在pCTCON2质粒的NheI 和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得 到的pCTCON2-T质粒；所述目的蛋白的DNA片段插入所述pCTCON2_T质粒的Xcm I 酶切位点；所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，利用流式细胞术进行步 骤(3)中的所述分选。4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步骤(2)中，将所述DNA文库 展示在所述酵母表面包括如下步骤①提取所述DNA文库的质粒转化所述酵母，得到重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：张林琦，林章凛，史宣玲，刘中华，左腾，徐望晖，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]