治疗性多肽丙肝疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种治疗性多肽丙肝疫苗及其制备方法。丙型肝炎病毒是输血后肝炎的主要病原体，目前ＨＣＶ感染治疗方法，局限于疗效欠佳的干扰素和利巴韦林；寻求一种高效预防和治疗ＨＣＶ感染的方法是当务之急。本发明专利技术对ＨＣＶＮＳ３区和ＮＳ５区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成１０个氨基酸残基长度的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的１０个氨基酸残基的多肽链，这两个多肽链的纯度９５％－９９．９９％，将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，具体而言，是一种可用于治疗仪型丙型肝炎病毒感染的人工合成的多肽，多肽序列是从丙肝型病毒氨基酸序列中筛选出来的，具有显著的激活体液免疫和细胞免疫的活性。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的主要病原体，HCV急性感染后70％以上转为慢性感染，随病程延长有一定比例发展为肝硬化和肝细胞癌。目前对多种病毒性疾病还没有特效的治疗，疫苗是预防病毒性疾病的有效手段，同时人们正在积极研究，希望能研制慢性病毒感染的治疗性疫苗。HCV感染力弱，没有理想的细胞模型，更主要是HCV病毒基因高度变异性，逃逸机体免疫系统的识别，因此，给HCV疫苗研究带来了很大的困难。目前HCV感染治疗方法，局限于疗效欠佳的干扰素和利巴韦林。寻求一种高效预防和治疗HCV感染的方法是当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供治疗性多肽丙肝疫苗，其为具有高效免疫原性的并可以激发高效细胞免疫的多肽。本专利技术的另一目的在于提供一种治疗性多肽丙肝疫苗的制备方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为一种治疗性多肽丙肝疫苗，其特殊之处在于所述的治疗性多肽丙肝疫苗为多肽链，其两个多肽链的氨基酸序列分别为HCVNS3pvsylkgssg(10个氨基酸残基)HCVNS5nmvyattsrs(10个氨基酸残基) 上述的治疗性多肽丙肝疫苗的多肽纯度为95％-99.99％。一种治疗性多肽丙肝疫苗的制备方法，其采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。上述的每条抗原肽的Fmoc法固相合成与标记的具体步骤如(1)-(9)按照多肽疫苗的序列从羧端向氨端依次合成。(1)第一个氨基酸与树脂的连接；(2)第一个氨基酸与树脂的偶联率测定；(3)Fmoc基团的脱保护；(4)第二个氨基酸的偶联反应第二个氨基酸的连接采用原位活化法；(5)肽链的延伸反应重复步骤(3)、(4)，直至偶联得到所需多肽链；(6)肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)；(7)肽链的侧链去保护及从树脂上的切割，得到合成抗原肽粗品；(8)合成抗原肽的脱盐；(9)HPLC纯化抗原肽；(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。本专利技术相对于现有技术，其优点如下对HCV NS3区和NS5区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成10个氨基酸残基长度的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的10个氨基酸残基的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序列分别为HCVNS3pvsylkgssg(10个氨基酸残基)，HCVNS5nmvyattsrs(10个氨基酸残基)，多肽疫苗的纯度95％-99.99％。具体实施例方式本专利技术对HCV NS3区和NS5区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成10个氨基酸残基长度的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的10个氨基酸残基的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序列分别为HCVNS3pvsylkgssg(10个氨基酸残基)，HCVNS5nmvyattsrs(10个氨基酸残基)，多肽疫苗的纯度95％-99.99％。上述的治疗性多肽丙肝疫苗的制备方法具体步骤如下一、多肽的固相合成本研究采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。1.材料和设备1.1主要试剂和材料Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基树脂(2-Chlorotrityl chloride resin树脂)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)、N，N二异丙基乙胺(DIEA)、1-氧-3-双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、二环己基碳二亚胺(DCC)、三氟乙酸(TFA)购自上海吉尔生化公司，乙二硫醇(EDT)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、茚三酮、哌啶、甲醇、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。1.2实验仪器设备 1.3主要试剂配制(1)DMF分析纯DMF，加千分之一茚三酮负压重蒸，去溜头溜尾。(2)脱保护(DEBLOCK)试剂分析纯哌啶，常压重蒸，去溜头溜尾，配置成25％的DMF溶液。(3)茚三酮显色剂5％茚三酮无水乙醇溶液、80％苯酚和KCN(2ml 0.001M KCN，98ml哌啶)。(4)切割试剂将TFA、硫代苯甲醚、水、苯酚和EDT按照82.5∶5∶5∶5∶2.5的体积比混匀。(5)PBS(pH 7.4)0.2g KH2PO4，2.9g NaHPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl，去离子水补充至1000ml，调节pH为7.4。(6)ELISA包被缓冲液(pH 9.60.05mol/L Na2CO3-NaHCO3)1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，去离子水补充至1000ml。(7)ELISA洗涤液含0.05％Tween20的PBS。(8)ELISA抗体稀释液含0.2％BSA的PBS。(9)ELISA底物缓冲液1.84g Na2HPO4，0.47g柠檬酸，去离子水补充至100ml。(10)TMB显色液0.5ml TMB(10mg/5ml无水乙醇)，10ml底物缓冲液，32μl 0.75％H2O2。(11)ELISA终止液2mol/L的H2SO4。2.方法2.1抗原肽的Fmoc法固相合成与标记按照多肽疫苗的序列从羧端向氨端依次合成。(1)第一个氨基酸与树脂的连接将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂1g置于干燥洁净的肽合成柱中，加入8ml DCM，溶胀5min，真空吸弃溶剂。分别取2mmol Fmoc氨基酸和5mmolDIEA，溶于8ml DCM，并加入于树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用10ml DMF洗涤树脂2次，每次2min。加入10ml DCM/甲醇/DIEA(80∶15∶5)，轻轻摇动反应10min，真空吸弃溶剂。重复一次。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂，N2吹干。(2)第一个氨基酸与树脂的偶联率测定精确称取2mg干燥的Fmoc氨基酸-树脂置于比色杯中，加入3ml 20％哌啶/DMF，轻轻摇动反应10min，用20％哌啶/DMF作为空白对照调零，紫外分光光度计测定样品的290nm光吸收值。重复测定2次，取平均值。偶联率通过以下公式计算偶联率(mmol/g)＝(Abs样品)/(样品重量mg×1.75)(3)Fmoc基团的脱保护向树脂中加入10ml脱保护(DEBLOCK)试剂，混匀，室温轻轻摇动反应5min。弃溶剂，用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。用6ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂。取少量树脂样品，用茚三酮显色法(Kaiser法)快速测定树脂上的游离氨基含量将树脂2ml用乙醇洗涤3次，分别加入2滴5％茚三酮、80％苯酚和KCN(2ml0.001M KCN98ml哌啶)，充分混匀，120℃加热4～6min。判断Fmoc基团的去保护反应程度。(4)第二个氨基酸的偶联反应第二个氨基酸的连接采用原位活化法，取2mmol的Fmoc氨基酸、4.0mmol的TBTU和4.0mmol的HOBT，加入最少量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗性多肽丙肝疫苗，其特征在于：所述的治疗性多肽丙肝疫苗为多肽链，其两个多肽链的氨基酸序列分别为：　　　　ＨＣＶＮＳ３：ｐｖｓｙｌｋｇｓｓｇ（１０个氨基酸残基）　　　　ＨＣＶＮＳ５：ｎｍｖｙａｔｔｓｒｓ（１０个氨基酸残基）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：闫小君，郭晏海，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]