一种重组蛋白及药物组合物与应用制造技术

本发明专利技术涉及领域生物医药，特别涉及一种重组蛋白及药物组合物与应用。本发明专利技术所述重组蛋白包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽具有特异的氨基酸序列，特异的空间结构，因此，具有强免疫原性，尤其是细胞免疫，且通过点突变解决了人体安全性问题。本发明专利技术所述药物组合物包括所述重组蛋白和佐剂能激发和强化针对人乳头瘤病毒E6、E7蛋白的特异性T细胞免疫应答，有效的治疗宫颈癌，具有良好的应用前景。

Recombinant protein and medicinal composition and application thereof

The invention relates to the field of biological medicine, in particular to a recombinant protein and a pharmaceutical composition and an application thereof. The amino acid sequence of recombinant proteins including E6 fusion peptide E7 and human papilloma virus of deformable body with a specific, specific spatial structure, therefore, has strong immunogenicity, especially cellular immunity, and the point mutation to solve the issues of human security. Specific T cell immune response including the recombinant protein and adjuvant can stimulate and strengthen the human papilloma virus E6 and E7 protein in the composition of the present invention, effective treatment of cervical cancer, and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白及药物组合物与应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种重组蛋白及药物组合物与应用。
技术介绍
子宫颈癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中排名第二，仅次于乳腺癌。全世界约26.45亿的女性(大于15岁)面临宫颈癌的风险，每年53万例宫颈癌新发病例，占所有女性肿瘤的12％，死亡病例达26.5万例。中国约有5.52亿大于15岁的女性面临发展为宫颈癌的风险，最新统计显示，中国每年有61691名女性诊断为宫颈癌，其中29526名死亡，感染HPV16/18型的病例中，只有3.8％在一定时间显示正常的细胞学特点，76.1％发展为侵润性宫颈癌。已知子宫颈癌主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起。70％以上HPV阳性的宫颈癌病变中存在HPV基因组的整合，其中以HPV16型和HPVl8型为主，其中约60％的宫颈癌与HPV16感染相关，约10％的宫颈癌与HPV18相关。对HPV的致癌机理研究显示：E6和E7基因是致癌型HPV的主要转化基因,两者共同具有锌指结构域的特征(zinc-bindingstructures)。HPVE6、E7蛋白分别可以与抑癌蛋白p53和pRb相结合，引起p53降解与pRb功能性灭活,这是HPVE6、E7癌蛋白干扰细胞周期负调控功能的主要机制，能导致上皮细胞永生化，细胞生长、增殖失控，细胞凋亡异常。因此，在HPV中E6和E7蛋白对宫颈癌的发病起主要作用，从而成为制备用于治疗和预防宫颈癌疫苗的主要靶抗原。宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗、化疗等只对早期患者有一定的疗效，且治疗创伤大，不能防止HPV再度感染。研究显示，对于由病毒引起的肿瘤和传染性疾病，免疫疗法是一种有效的方法。重组蛋白疫苗纯度高安全性好，但其免疫原性低，蛋白更倾向于刺激体液免疫，不能诱导强的细胞免疫。研究还表明，单独使用原核表达的HPVE6或E7蛋白作为治疗性疫苗有一定的防治效果，但使用野生型的E6或E7蛋白作为治疗药物，由于其治疗效果不显著而无应用价值，且由于是未经改造的野生型癌基因产物，具有肿瘤转化活性，安全性受到人们的质疑。含有E6和E7基因的病毒，或以质粒为载体的DNA疫苗，由于可能整合到细胞基因组中，也存在安全性问题。用合成的多肽作为疫苗，其免疫原性低且受MHC限制，使用范围有限。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组蛋白及药物组合物以应用，以有效解决现在技术中重组蛋白疫苗免疫免疫原性低、不能诱导强的细胞免疫以及安全性问题等技术缺陷。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种重组蛋白，包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽；所述人乳头瘤病毒为16型和/或18型。优选的，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV16型E6蛋白N端第1-83位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白N端的第1-62位氨基酸序列、HPV16型E6蛋白C端的第69-151位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白C端的第48-98位氨基酸序列，其中HPV16型E6的突变位点为F47R、L50G、C63G、C106R；HPV16E7的突变位点为Y23G、C24G、Y25G、C58G、C91G；优选的，所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV18型E6蛋白N端第1-86位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白N端的第1-67位氨基酸序列、HPV18型E6蛋白C端的第72-158位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白C端的第53-105位氨基酸序列，其中HPV18型E6的突变位点为F49R、L52G、C65G、C108G；HPV18E7的突变位点为L26G、C27G、H28G、C65G、C98G。进一步的，在一些实施方案中，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列；或SEQIDNO.1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示氨基酸序列；或SEQIDNO.2所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。优选的，所述重组蛋白还包括免疫刺激分子。其中，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体、TNF-ɑ、IL-2、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1ɑ和CD40配体、钙网蛋白N端、热休克蛋白、泛素中的至少一种。优选的，所述免疫刺激分子为钙网蛋白N端或fms样酪氨酸激酶3配体。进一步的，在一些实施方案中，所述钙网蛋白N端具有如SEQIDNO.3所示氨基酸序列；或SEQIDNO.3所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fms样酪氨酸激酶3配体具有如SEQIDNO.4所示氨基酸序列；或SEQIDNO.4所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.4所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。优选的，所述免疫刺激分子与所述人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽以连接肽连接。在一些实施方案中，所述连接肽具有如SEQIDNo.9所示氨基酸序列。本专利技术还提供了编码所述重组蛋白的核苷酸序列。优选的，所述SEQIDNO.1所示重组蛋白具有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列。优选的，所述SEQIDNO.2所示重组蛋白具有如SEQIDNO.6所示核苷酸序列。优选的，所述SEQIDNO.3所示钙网蛋白N端具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列。优选的，所述SEQIDNO.4所示fms样酪氨酸激酶3配体具有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列。本专利技术还提供了一种重组表达载体，含有所述核苷酸序列。本专利技术还提供了一种工程菌，含有所述重组表达载体。本专利技术还提供了一种药物组合物，包括所述的重组蛋白和佐剂。其中，优选的，所述佐剂为油/水乳化剂ISA51、TLR3激动剂polyI:C、表面活性剂类免疫刺激复合物ISCOMATRIX、CpG-ODN中的至少一种。进一步，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括可药用载体。优选的，所述可药用载体包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种。本专利技术还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备提高针对人乳头瘤病毒的体液免疫和细胞免疫免疫应答的药物中的应用。本专利技术还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备治疗和/或预防人乳头瘤病毒引起疾病的药物中的应用。其中，优选的，所述人乳头瘤病毒引起的疾病为子宫颈癌。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种重组蛋白及药物组合物与应用。本专利技术所述重组蛋白包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽具有特异的氨基酸序列，特异的空间结构，因此，具有强免疫原性，尤其是细胞免疫，且通过点突变解决了人体安全性问题。本专利技术所述药物组合物包括所述重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组蛋白，其特征在于，包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽；所述人乳头瘤病毒为16型和/或18型。

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽；所述人乳头瘤病毒为16型和/或18型。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV16型E6蛋白N端第1-83位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白N端的第1-62位氨基酸序列、HPV16型E6蛋白C端的第69-151位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白C端的第48-98位氨基酸序列，其中HPV16型E6的突变位点为F47R、L50G、C63G、C106R；HPV16E7的突变位点为Y23G、C24G、Y25G、C58G、C91G；所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV18型E6蛋白N端第1-86位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白N端的第1-67位氨基酸序列、HPV18型E6蛋白C端的第72-158位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白C端的第53-105位氨基酸序列，其中HPV18型E6的突变位点为F49R、L52G、C65G、C108G；HPV18E7的突变位点为L26G、C27G、H28G、C65G、C98G。3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列；或SEQIDNO.1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示氨基酸序列；或SEQIDNO.2所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。4.根据权利要求1-3任意一项所述的重组蛋白，其特征在于，还包括免疫刺激分子。5.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体、TNF-ɑ、IL-2、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1ɑ和CD40配体、钙网蛋白N端、热休克蛋白、泛素中的至少一种。6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫刺激分子为钙网蛋白N端或fms样酪氨酸激酶3配体。7.根据权利要求6所述的重组蛋白，其特征在于，所述钙网蛋白N端具有如SEQIDNO.3所示氨基酸序列；或SEQIDNO.3所示氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建强，葛君，陈思，陆凤，任苏林，周童，戚凤春，赵志强，刘俊林，殷相平，蒲秀英，徐继英，王建锋，焦文强，
申请(专利权)人：苏州远康生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32