离析核酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种离析核酸的方法，它包括使流体中含有天然形态核酸的试样与具有玻璃表面的磁性颗粒，在核酸能直接结合到玻璃表面上去的条件下接触，该玻璃表面基本上无孔或有直径小于１０ｎｍ的孔，和从流体中分离结合的核酸。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有玻璃表面的磁性颗粒，以及使用玻璃颗粒在离液序列高的盐存在条件下纯化生物物质，特别是核酸的方法。本专利技术还涉及离析这些生物物质的方法以及浓缩生物物质并将其从高浓度盐溶液转移到低浓度盐溶液的方法。许多生物物质，特别是核酸，要从其自然环境中将它们离析出来存在着特殊的困难。一方面，它们常以非常低的浓度存在，另一方面，它们经常与许多其它固体和溶解物质一起存在，使它们难以被离析或测量。因为这个原因，近年来提出了许多方法和材料用于把核酸从其自然环境中离析出来。例如在Proc.Natl.Acad.USA 76,615-691(1979)中提出了把琼脂糖凝胶中的核酸在碘化钠存在下结合到磨碎的火石玻璃上的方法。在高氯酸钠存在条件下，在玻璃粉上纯化DNA质粒以去除细菌的方法。在Anal.Biochem.121，382-387(1982)上有介绍。在DE-A 37 34 442中介绍了用醋酸通过噬菌体颗粒沉淀把单旋M13噬菌体的DNA离析到玻璃纤维过滤器上并用高氯酸裂解这些噬菌体颗粒。结合到玻璃纤维过滤器上的核酸经洗涤后用含薄荷醇缓冲液洗脱到三甲醇氨基甲烷/乙二胺四乙酸缓冲液中。从λ噬菌体中纯化DNA的类似方法在Anal.Biochem.175，196-201(1988)有介绍。按过去已知的方法，核酸必须在离液序列高的盐溶液中有选择地结合到玻璃表面并且把核酸与污染物如琼脂糖，蛋白质或细胞碎片分离。按照过去的方法，为把玻璃颗粒与污染物分离，如是颗粒则通过离心分离，如是液体则通过玻璃纤维过滤器滤出。但是这是一个卡关的步骤，它限制了这些方法用于处理大量样品。通过加入盐和乙醇产生沉淀后，用磁性颗粒来固定核酸的方法在Anal.Biochem.201，166-169(1992)和PCT GB 91/00212有介绍。在这个方法中核酸随磁性颗粒被凝集。通过加磁场并进行一次洗涤把凝集物和原始溶剂分离。经一次洗涤后，核酸被溶于三甲醇氨基甲烷缓冲液中。但是此法有缺点，其中沉淀作用对核酸不是选择的。而是许多固体和溶解物质也被凝集出来。结果，这种方法不能用来去除可能存在的特定酶反应的大量抑制剂。一种有磁性颗粒埋置其中的多孔玻璃在US-A-4,233,169中有介绍。磁性多孔玻璃在市场上可以买到，它在多孔的特种玻璃基体中包容磁性颗粒，并带有含链酶抗生物素的包复层。这种产品可以用来离析生物物质，例如蛋白质或核酸，如果在络合物制备时对其作些修饰，则可以共价结合到生物素上。本专利技术的任务是提供更好的材料来固定生物物质以及一种简单的方法来离析生物物质，特别是核酸，它也适用于常规诊断过程。本专利技术主要涉及具有基本上无孔或孔径小于10nm的玻璃外表面的磁性颗粒。本专利技术还涉及具有玻璃表面的铁磁颗粒，一种离析生物物质特别是核酸的方法，以及一种制备磁性玻璃颗粒的方法。按照专家的说法，颗粒是直径小的固体材料。这里谈到的颗粒也常称为色素。按照本专利技术，平均颗粒尺寸小于100μm的颗粒特别适用。更为适用的是平均颗粒尺寸10-60μm的颗粒。颗粒尺寸的分布最好较均匀。特别是不含尺寸＜10μm或＞60μm的颗粒。会受磁体吸引的材料被认为是磁性的，例如铁磁或超顺磁材料。此外，被叫做软磁的那些材料也被认为是磁性的，如铁素体。按照本专利技术特别优选的是铁磁材料，特别是它们还没有被预磁化过。在这里预磁化意指与磁体接触，从而增加了剩磁。特别优选的是铁磁材料，如磁铁矿(Fe3O4)或Fe2O3。颗粒的外表面意指邻接的表面，从表面向颗粒外面的环境画垂线，它不穿会过颗粒自己。孔就是颗粒外表面的凹进处。该表面一直深达颗粒的这个位置，即在凹进处表面向颗粒相邻环境画的垂线至少穿过该颗粒一次。此外，孔深达颗粒内的深度大于孔的半径。按照本专利技术的玻璃就是一种包含硅的非晶形材料。玻璃可以包含其它材料如下B2O3(0-30％)Al2O3(0-20％)CaO (0-20％)BaO (0-10％)K2O (0-20％)Na2O (0-20％)MgO (0-18％)Pb2O3(0-15％)玻璃还可以包含较小百分数(0-5％)的许多其它氧化物如Mn2O3，TiO2，As2O3，Fe2O3，CuO，CoO等。由硼硅酸盐玻璃，火石玻璃或二氧化硅组成的表面被证实特别有效。根据核酸的收率，特别优选的是硼硅酸盐玻璃，其氧化硼含量超过25％。SiO2/B2O3成分为70/30的玻璃是特别优选的。按照本专利技术特别优选的是用溶胶凝胶法成型然后干燥和压缩的玻璃。这种方法的基本原理是已知的，并有有所报道，例如C.J.Brinker，G.W.Scherer“溶胶凝胶科学-溶胶凝胶工艺的物理化学”，AcadamicPress Inc.1990，溶胶凝胶光学，工艺和应用，Lisa C.Klein，Ed.，Kluwer Academic Publishers 1994，p.450 ff.，和DE-A-1941191，DE-A-3719339，DE-A-4117041和DE-A-4217432。但是到目前为止，磁性颗粒的原理尚未有报道。但是这种方法可以用来创造一种磁性颗粒，当用它们来离析生物物质特别是核酸时所具有的令人惊奇的特性是没有预计到的。在凝胶溶胶法中，构成骨架的成分，如SiO2，B2O3，Al2O3，TiO2，ZrO2，GeO2的醇盐与其它组分如在酒精溶液中的氧化物和盐化合，然后被水解。下面的方程描写了制备硼铝硅酸钠玻璃的方法NaOH+B2O3+Al(OR)3+Si(OR)4→-ROH+H2O]]>→NaOH+B2O3+⟨Al(OH)3⟩+⟨Si(OH)4⟩→]]> 加入水以使起始的组分开始水解。因为碱性离子对硅酸酯的水解速度有催化作用，所以反应进行得相当快。一旦凝胶形成，就可以利用热处理过程进行干燥并密实以形成玻璃。溶胶色素的比例对本专利技术的磁性色素的收率有相当大的影响。比例受如下的原因限制，色素的份额必须小到所产生的浆状物仍能被泵送和喷雾。如果色素的份额太小，则粉末部分如非磁性材料变得太大并造成干扰。从色素的收率来讲，发现10-25克色素∶100毫升溶胶的比例是适用的。为造备粉末，浆液最好通过管嘴喷雾，气溶胶在下降过程中就被干燥了。管嘴最好要加热以加速浆液的干燥。根据管嘴的尺寸，管嘴温度优选地为120-200℃。通过选用足够的蒸发速度但又避免过热可以找到折中方案。为了收率的最佳化，密实温度应尽可能高。但是如果过高的话，颗粒会粘在一起并形成结块，它必须被筛掉。在过高的温度下对颗粒作进一步处理会造成丧失磁性。因此过高的温度应该不于考虑。基本无孔的表面意指孔(如上所述)所占面积小于5％的表面，优选地小于2％，特别优选地小于1％。如果有孔存在，其直径最好小于10nm，特别优选地为小于1nm。按照本专利技术特别优选的颗粒是含有带TiO2包层的云母核的颗粒，磁性颗粒固定在其上面。在这种设计中，形成的复合材料由玻璃层包围。核和磁性颗粒两者都是晶状无孔的。云母表面的未被磁性颗粒占据的空间由玻璃层包复，它要比磁性颗粒顶部要厚，结果基本上是一种无孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离析核酸的方法，它包括 将流体中含有天然形态核酸的试样与具有玻璃表面的磁性颗粒在核酸能直接结合到玻璃表面上去的条件下接触，和 从流体中分离结合的核酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J克莱恩，T沃尔特，H哈尔蒂希，C列斯尼亚克，M梅恩伊格，M里德林，H施密特，
申请(专利权)人：罗赫诊断器材股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]