分离核酸的方法技术

本发明专利技术要解决的问题是提供可供选择的使用在含水吸附液中的可供选择的物质用于核酸的色谱纯化的方法，目的在于促进核酸与基材如无机物载体结合。本发明专利技术提供了纯化核酸的方法，其包括以下步骤：（ａ）将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物包含（ｉ）缓冲水溶液、（ｉｉ）高浓度盐、（ｉｉｉ）与水混溶的非酸性有机化合物、和（ｉｖ）核酸；（ｂ）任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，（ｃ）将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤（ａ）的组合物中盐的浓度；和（ｄ）将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸；和任选地（ｅ）使解吸核酸从步骤（ｄ）的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸的纯化。特别地，本专利技术涉及将存在于含水吸附液中的核酸吸附到固体基材上的方法。
技术介绍
许多生物物质，特别是核酸，目前特有的问题是将它们与它们所在的自然环境相分离。一方面，它们通常以非常小的浓度存在，另一方面，通常发现它们存在于许多其它固体和溶解物质中，如存在于胞溶之后的物质中。这使它们难以分离或测量，特别是在检测特定核酸或检测核酸的特定性质的生物特异性试验中。这种生物特异性试验在诊断学和生物分析领域的研发中起重要作用。生物特异性试验的例子为杂交试验、免疫试验、和受体-配体试验。杂交试验使用特定的碱基对用于核酸分析物如RNA和DNA的分子检测。因此，长度为18到20个核苷酸的寡聚核苷酸探针能够特异性识别所选择的如人类基因组中的互补序列。另一个需要两种寡聚核苷酸引物选择性结合的试验是US4,683,195中描述的聚合酶链式反应(PCR)。该方法通过在若干循环中在脱氧核苷酸三磷酸的存在下，通过热稳定的聚合酶将特定的核酸区域选择性扩增到可检测的水平。如上所述，核酸在上述试验之一中进行分析或用于其它方法之前，需要将它们从包含不同组分如蛋白质和非蛋白质组分的复合混合物的生物样品中分离或纯化。通常，对于第一步，使用使在研组分即核酸富集的方法。经常地，这些组分包含于细菌细胞、真菌细胞、病毒粒子、或更复杂生物体的细胞如人血细胞或植物细胞中。核酸作为在研组分也可以称为“靶组分”。为释放所述细胞或粒子的内容物，它们可用酶或化学品处理，使这些生物体的细胞壁和细胞膜溶解、降解或变性。该方法通常称为胞溶。得到的包含这种胞溶物质的溶液称为胞溶产物。在胞溶过程中经常遇到的问题是降解靶组分的其它酶如脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在胞溶过程中与靶组分接触。这些降解酶也可在胞溶之前存在于细胞外部或在不同的细胞隔室内在空间上被分开，而现在接触到靶组分。该方法期间释放的其它组分可为如属于脂多糖类的内毒素，其对细胞有毒性并能够使人类或动物治疗用产品出现问题。在样品制备的胞溶步骤之后的下一步中，进一步使核酸富集。通常在用于基于探针的试验之前将核酸从复杂的胞溶混合物中提取出来。核酸的提取有几种方法。序列依赖性或生物特异性的方法包括例如亲和色谱法或与固定探针的杂交。序列非依赖性或物化方法包括例如使用苯酚-氯仿的液-液提取法、用纯乙醇或异丙醇沉淀、用滤纸提取、用胶束形成试剂如十六烷基三甲基溴化铵提取、与固定的嵌入染料如吖啶衍生物结合、吸附于基材如硅胶或硅藻土上、在离液序列高的条件下吸附于可磁吸引的玻璃粒子(MGP)或有机硅烷粒子。优选核酸与具有二氧化硅表面的基材直接结合，原因之一为核酸无需修饰，并且甚至天然的核酸也可以结合。虽然可使用其它的表面，但用于提取目的的特别兴趣在于将核酸吸附到玻璃表面上。近年来已经提出通过使用核酸与基材如玻璃表面的结合行为将核酸与它们的自然环境分离的许多过程。当想要使核酸游离时，经常使用离液剂如硫氰酸胍或阴离子的、阳离子的、两性离子的或非离子的洗涤剂。还可以有利地使用迅速降解这些酶或多余蛋白质的蛋白酶类。在例如细胞胞溶和/或细胞器如线粒体、质体、细胞核或其它含核酸的细胞器胞溶之后游离的核酸，可通过如下方式纯化核酸使其结合于基材如无机物载体，洗涤结合有核酸的所述无机物载体，并使所述核酸从所述无机物载体释放，即解吸。对于洗涤步骤的条件，由本领域的技术人员进行选择，在所选的洗涤条件下，使核酸保持吸附于无机物载体上。优选地，大于40％，更优选大于50％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于99％的核酸保持吸附于无机物载体上。对于解吸步骤条件，由本领域的技术人员进行选择，在所选条件下，使核酸从无机物载体释放。优选地，大于40％，更优选大于50％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于99％的核酸被从无机物载体释放。在离液盐的存在下将核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子在本领域是已知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)第615-619页)并且为核酸的色谱纯化和分离过程奠定了基础。本领域还已知使用高浓度的离液盐如碘化钠、高氯酸钠、和硫氰酸胍从胞溶产物中分离和纯化RNA和DNA的方法(Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。得自细菌的质粒DNA在高氯酸钠的存在下在玻璃粉上的纯化在Marko，M.A.等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387中有所描述。在DE 3724442中，描述了通过用乙酸使噬菌体粒子沉淀并用高氯酸盐使噬菌体粒子胞溶而分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤与玻璃纤维过滤器结合的核酸，然后用含甲醇的Tris/EDTA缓冲溶液洗脱。从λ噬菌体纯化DNA的类似过程在Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中有所描述。该过程要求核酸在离液盐溶液中选择性地与玻璃表面结合，并从污染物如琼脂糖、蛋白质或细胞残余物中分离核酸。为从污染物中分离玻璃粒子，可通过离心分离粒子或吸引液体使其通过玻璃纤维过滤器。然而，这是一个限制性步骤，防止使用该过程来处理大量的样品。在通过加入盐和乙醇沉淀之后，使用磁性粒子固定核酸是更有利的，其在例如Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169和WO 91/00212中有所描述。在这个过程中，核酸与磁性粒子一起粘合。通过施加磁场使粘合物从原溶剂中分离并进行洗涤步骤。一次洗涤步骤之后，将核酸溶解于Tris缓冲溶液中。然而，这个过程有一个缺点，在于沉淀对于核酸不是选择性的。而是还粘合有多种固体和溶解物质。结果是，这个过程不能用于除去可能存在的显著量的特定酶促反应的任何抑制剂。磁性的多孔玻璃也是有市售的，其在多孔的特别是玻璃基质中包含磁性粒子，并由包含链亲和素的层覆盖。如果生物材料在复杂的制备步骤中经过修饰使得它们与生物素共价结合，则上述产物可用于分离这些生物材料，如蛋白质或核酸。可磁化的特定吸附剂被证明是非常有效的，并适用于自动样品制备。亚铁磁的和铁磁的以及超顺磁性颜料被用于这一目的。最优选的MGP为在WO01/37291中描述的那些。通过在高浓度盐的存在下将核酸吸附于基材上如无机物基材来纯化核酸也适用于其它的复杂混合物。其例子是分子生物学领域的技术人员已知的，包括例如在核酸的体外合成如PCR、限制性内切酶消化、连接反应等之后得到的反应混合物。例如在Vogelstein，B.和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中，提出了使琼脂糖凝胶中的核酸在碘化钠的存在下结合于研磨的燧石玻璃的过程。通过在高浓度盐的存在下将核酸吸附于基材上如无机物基材来纯化核酸的另一个应用是除去可能已经与核酸共同纯化的热原(pyrogenic)污染物。还不完全清楚核酸在离液剂的存在下与无机物载体结合的机理。据假设，核酸和溶剂之间的相互作用受到影本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化核酸的方法，其包括以下步骤：（ａ）将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物含有　（ｉ）缓冲水溶液，（ｉｉ）高浓度盐，（ｉｉｉ）包含式Ⅰ官能团的与水混溶的非酸性有机化合物：Ｗ＊Ｚ（式Ⅰ）其 中Ｗ为碳原子或硫原子，和Ｚ为氧原子或氮原子，和（ｉｖ）核酸；（ｂ）任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材，然后，（ｃ）将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤（ａ）的组 合物中盐的浓度，和（ｄ）将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸，和任选地（ｅ）使解吸核酸从步骤（ｄ）的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F贝格曼，M柯西格泽，T瓦尔特，K魏因德尔，R齐伦斯基，E萨洛芬，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]