一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法。用叔丁基甲醚溶解样品，加氢氧化钠除杂质，加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶，液相色谱‑串联质谱仪检测，内标法定量。本发明专利技术的样品前处理方法，回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3μg/kg，在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。本发明专利技术方法充分应用氯霉素在各溶剂间溶解度的差异，解决了蜂胶样品的溶解、氯霉素的提取和干扰物的净化等问题。操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确。

Method for determination of chloramphenicol residues in propolis gum

The invention discloses a method for the determination of chloramphenicol residues in propolis. Using tert butyl ether to dissolve the sample, adding sodium hydroxide to remove the impurities, reduce the solubility of chloramphenicol with hexane, followed by sodium acetate buffer stripping stripping solution of chloramphenicol, transferred into alkaline after extraction with ethyl acetate, dried with nitrogen concentration after water re dissolution, liquid chromatography tandem mass spectrometer, internal standard method. The processing method of the present invention samples, the correlation coefficients of regression equation reached more than 0.99, the limit of detection was 0.3 g/kg, 0.3 g/kg ~ 3 g/kg concentration on recovery rate is 80% ~ 110%, the relative standard deviation is less than 15% in the laboratory. The method of the present invention makes full use of the solubility difference of chloramphenicol in each solvent, solves the problems of the dissolution of the propolis sample, the extraction of chloramphenicol and the purification of the interfering substance. Simple operation, high sensitivity, strong anti-interference ability, qualitative and quantitative accuracy.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药残留检测
，具体涉及蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法。
技术介绍
蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入其上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶植物来源广泛，化学成分复杂，已从中检测出二十余类、三百多种天然成分，其中包括一百多种类黄酮类化合物、一百多种芳香类化合物，还有丰富的有机酸、萜烯类物质、维生素、木脂体、酶类、矿物元素、氨基酸、多糖等具有生物活性的天然成分。蜂胶化学成分复杂，要检测其中的氯霉素残留量，不仅对仪器灵敏度、重现性与选择性的要求非常高，更关键的问题在于需要良好的样品前处理手段来提取和净化目标化合物。目前动物肌肉与内脏、水产品、乳制品、蜂蜜和蜂王浆等动物源食品中氯霉素残留量的检测方法已比较完善，国家标准、行业标准和相关文献均可参考，但均不适用于蜂胶中氯霉素残留量的检测。对蜂胶样品而言，可供参考的文献非常少，蜂胶的溶解、氯霉素的提取和干扰杂质的去除，均是难点所在，可以说目前没有较为理想的样品处理方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法，解决蜂胶的溶解性、有效除去杂质、完整提取其中的氯霉素三者之间的矛盾。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种蜂胶原胶中氯霉素的残留量的测定方法，其步骤为：采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。进一步地，所述的测定方法的步骤为：称取样品1g，于离心管中，加20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液30μL，加叔丁基甲醚8mL，涡旋3min，使蜂胶充分溶解，加1％氢氧化钠溶液10mL，涡旋2min，8000r/min离心5min，上层叔丁基甲醚移入另一离心管，先加0.2mol/L乙酸钠溶液10mL，再加正己烷7mL，涡旋2min，4000r/min离心5min，下层乙酸钠溶液移入另一离心管，上层再加0.2mol/L乙酸钠溶液5mL反萃一次，4000r/min离心5min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH至10±0.2，加乙酸乙酯10mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，上清液移入试管中，45℃氮吹浓缩至干；吹干的玻璃试管中加水1mL溶解待测化合物，旋涡2min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。所述内标法定量的标准曲线的制备方法为：精密量取20ng/mL氯霉素标准工作液和20ng/mL内标标准工作液适量，用水稀释，配制成氯霉素浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为0.3μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以氯霉素和氘代氯霉素的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：AtlantisT3，4.6mm×100mm，粒径3μm；流动相：体积比65％的甲醇－体积比35％的水；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL。所述的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：-4000V；雾化气：10；气帘气：10；碰撞气：10；辅助加热气温度：500℃；去集簇电压：-32V；聚焦电压：-75V；入口电压：-6V；碰撞池出口电压：-10V；驻留时间：0.1s；定性、定量离子对和碰撞能量见表1。表1.定性、定量离子对和碰撞能量所述的测定方法的定性方法为：通过样品色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性；试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过下表2的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。表2.相对离子丰度的允许偏差范围相对离子丰度％＞50＞20～50＞10～20≤10允许的相对偏差％±20％±25±30±50所述的测定方法的定量方法为：取样品溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算；标准溶液及试料溶液中的氯霉素和氘代氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；标准曲线校准：由求得a和b，则试料中氯霉素残留量按式(2)计算：式中：As____标准溶液中氯霉素的峰面积；A'is____标准溶液中内标氘代氯霉素的峰面积；cs____标准溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；c'is____标准溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；c____样品溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；cis____试料溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；A____样品中氯霉素的峰面积；Ais____样品中内标氘代氯霉素的峰面积；X____供试样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克；V____溶解残余物的体积，单位为毫升；m____供试样品质量，单位为克；D____稀释倍数。本公式中稀释倍数为2；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。有益效果：目前，经过文献检索，得到两篇文章。对比文件1：中国蜂业2010,61(9)《高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中的氯霉素药物残留量》；对比文件2：色谱2012,30(3)《高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶中的氯霉素》。对比结果见下表3。表3：本申请与对比文件方法对比结果由表3可知：蜂胶检测中最难的就是用什么溶剂溶解，溶解后的氯霉素又如何分离出来，蜂胶所含成分众多，因此，对检测的干扰特别大。按照对比文件1或对比文件2的方法，基本上无法检测。因为对比文件中，溶解蜂胶之后，接着就加水或酸稀释，其目的是把氯霉素提取出来，但是，这样操作的话，蜂胶马上就沉淀出来，形成的包裹体把氯霉素也包在里面，根本没提取出来，后面的所有步骤都不起作用了。本专利申请的方法，采用不同的溶剂液液萃取，杂质去除了，氯霉素始终留在溶解度高的那层溶剂里，条件比较温和。溶剂选择的难度在于：就只能选择强碱、乙醇和醚这几种。其中，强碱破坏氯霉素，乙醇溶解后氯霉素和杂质不好分离，醚溶解后其实也很难把氯霉素分离出来。本专利中的方法，除了最后都是用乙酸乙酯萃取氯霉素之外，前面的提取和除杂质方法都跟对比文件完全不同。检测图谱的效果图对比非常明显。因此：本专利技术公开了一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法。采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)检测，内标法定量。本专利技术提供了蜂胶中氯霉素残留量检测的样品前处理方法，回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3μg/kg，在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。本专利技术方法充分应用氯霉素在各溶剂间溶解度的差异，解决了蜂胶样品的溶解、氯霉素的提取和干扰物的净化等问题。前处理操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量科学准确。附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法，其特征在于步骤为：采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱‑串联质谱仪检测，内标法定量。

【技术特征摘要】
1.一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法，其特征在于步骤为：采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤为：称取样品1g，于离心管中，加20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液30μL，加叔丁基甲醚8mL，涡旋3min，使蜂胶充分溶解，加1％氢氧化钠溶液10mL，涡旋2min，8000r/min离心5min，上层叔丁基甲醚移入另一离心管，先加0.2mol/L乙酸钠溶液10mL，再加正己烷7mL，涡旋2min，4000r/min离心5min，下层乙酸钠溶液移入另一离心管，上层再加0.2mol/L乙酸钠溶液5mL反萃一次，4000r/min离心5min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH至10±0.2，加乙酸乙酯10mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，上清液移入试管中，45℃氮吹浓缩至干；吹干的玻璃试管中加水1mL溶解待测化合物，旋涡2min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述内标法定量的标准曲线的制备方法为：精密量取20ng/mL氯霉素标准工作液和20ng/mL内标标准工作液适量，用水稀释，配制成氯霉素浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为0.3μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以氯霉素和氘代氯霉素的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：AtlantisT3，4.6mm×100mm，粒径3μm；流动相：体积比65％的甲醇－体积比35％的水；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琳智，谢敏玲，吴映璇，林峰，林海丹，姚仰勋，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44