本发明专利技术公开了一种用于检测水产品中氯霉素残留的化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于化学发光酶免疫分析领域。包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其中所述酶标板包被有包被抗原，所述试剂包括：酶标抗体即辣根过氧化物酶标记氯霉素抗体，氯霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。本试剂盒原理为将包被抗原吸附在微孔板上制成固相抗原，在氯霉素抗体上连接辣根过氧化物酶制成酶标记物，鲁米诺体系作为发光底物，建立了氯霉素酶促化学发光免疫分析法。该试剂盒灵敏度为0.0125ng/mL，批内变异系数小于8％，批间变异系数小于20％，鱼虾样品的回收率为87％——101％，检测线性范围0.0125——4.05ng/mL。本发明专利技术的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种氯霉素的化学发光酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于化学发光免疫分析
，用于水产品中氯霉素含量的检测。
技术介绍
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)最初是由委内瑞拉链丝菌的培养基中提取制得，是一类广谱抗生素。氯霉素曾在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽的疾病控制和治疗起到了重要作用。氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等，低浓度药物残留还会诱发致病菌的耐药性，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。在美国仅允许氯霉素应用于非食用性动物，规定在任何动物性食品中不得检出氯霉素。欧共体禁止氯霉素应用于产奶牛和产蛋鸡，在其他动物性食品中的含量也做了限制，规定最高残留量为100ng/kg。中国农业部已将氯霉素从2002年版《中国兽药典》中删除列为禁药，近年已规定在动物性食品中不得检出。作为全国淡水渔业第一省的湖北水产业，续十三年淡水产品总量保持全国第一。我省现有水产加工企业180家，其中加工出口企业19家。作为国家明令禁止使用的兽药，在水产品等动物源性食品中，氯霉素残留一直被列为重点必检项目之一。目前，应用广泛的CAP检测技术有液相色谱法(LC)、质谱法(MS)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。LC等大型仪器分析方法对设备和操作者有较高要求，样品处理方法复杂，检测时间长。目前已申请的氯霉素检测相关专利中较多是采用传统的酶联免疫吸附法检测，如:江南大学申请号为02137940，名为《一种动物性食品中氯霉素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法》；中国农业大学申请号为200410037254，名为《检测氯霉素的试剂盒》；中国农业大学申请号为200410037255，名为《一种检测氯霉素的试剂盒》；中国农业大学申请号为200410037258，名为《氯霉素的酶联免疫试剂盒》;中国农业大学申请号200410037259，名为《一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒》；北京望尔生物技术有限公司申请号200510086775，名为《一种检测动物性食品中氯霉素类药物的酶联免疫试剂盒》等。这一方法中常用的显色底物是四甲基联苯胺(TMB)或者邻苯二胺(OPD)，其中OPD具有致癌性，长期使用会对人体造成危害；且这类底物较不稳定易受外界干扰使最终测定结果受到影响，如光照或金属离子会使底物自身显色。酶联免疫吸附法是以酶催化底物显色，通常需显色10——60分钟，使显色达到平台期，显色完毕后需用酸终止显色测定结果。另外部分专利涉及到胶体金试纸法，如:博顿生物技术(杭州)有限公司申请号200310109470，名为《检测氯霉素的免疫胶体金试纸及其制备方法》；云南大学申请号200610019376，名为《氯霉素胶体金检测试纸》等。该方法适操作简便，用时短用于大批量样品筛查，但灵敏度较低，结果不准确，易出现假阳性或假阴性。还有部分专利有采用液相色谱-串联质谱测定方法，如:上海徐汇区中心医院申请号200410067401，名为《一种蜂蜜中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法》；中国人民共和国江苏出入境检验检疫局申请号200810195887，名为《蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法》，这类方法测定结果准确，但样品前处理过程繁琐，需要用大量有机溶齐U，检测需要大规模仪器。此外还有天津生机集团股份有限公司申请号200810053150，名为《一种饲料或者兽药中违禁药物的快速检测方法》，该专利采用薄层色谱法检测违禁药物，这一方法操作简便，但样品处理过程中通常使用大量的有机溶剂，且检测结果只能定性判不能准确检测药物含量。江南大学申请号200910027458，名为《一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法》，采用免疫磁珠层析试纸条检测该方法与胶体金试纸法类似。江苏省原子医学研究所申请号200910182284，名为《一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒》，采用光激化学发光免疫分析法，该方法需突破多次标记，即将CAP-OVA包被在发光微粒上，合成生物素二抗，将链霉亲和素包被在感光微粒上。本专利技术将具有高度灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，操作简便，用时短，无需长时间显色及终止，且灵敏度高，特异性好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，用于水产品中氯霉素含量的检测。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。本专利技术主要采用化学发光酶免疫分析方法检测氯霉素。其技术方案:一种氯霉素化学发光酶免疫分析试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有抗原，其中包被抗原是由氯霉素小分子和载体蛋白通过EDC(碳二亚胺)法偶联制成的完全抗原；所述试剂包括:氯霉素系列标准溶液、酶标抗体、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤溶液、发光溶液。上述氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒中:所述包被抗原是由氯霉素小分子和载体蛋白通过碳二亚胺法偶联制成的完全抗原；所述微孔板为48孔或96孔或其他孔数的可拆卸或不可拆卸酶标孔板；所述酶标抗体是由辣根过氧化物酶和氯霉素抗体通过过碘酸钠法偶联制成；所述氯霉素系列标准溶液分别是从氯霉素纯品中稀释得到，氯霉素标准品中氯霉素浓度分别为:0.0125ng/mL、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、l.35ng/mL、4.05ng/mL ;所述化学发光液含缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸、过硼酸钠等。用所述的试剂盒检测氯霉素的方法，测定的基础是抗原-抗体反应。顺次向白色化学发光板中加入氯霉素标准溶液或处理好的样品和酶标抗体，温育洗涤后加入发光液检测发光值，以加入氯霉素标准品的发光值绘制标准曲线，以加入被测样品的发光值从标准曲线上计算被测样品中氯霉素的含量。所述试剂盒检测方法，向包被好的酶标板中每孔加入标准溶液或处理好的样品和酶标物，在25-49°C下温育15分钟。洗涤后，每孔加入发光液，1-5分钟后在化学发光检测仪上检测。以所得的标准品发光值，除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0)，以抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。所述的检测氯霉素的方法，其样品处理:鱼虾样品:取IOg去除脂肪的样品匀浆化，称量3g匀浆化的样品与6mL乙酸乙酯混合IOmin, 4000g离心5min,转移2mL乙酸乙酯上层到干净的玻璃管中，50°C温和氮气流蒸发乙酸乙酯，脂肪残留物溶于ImL正己烷混匀lmin，并加入ImL样品稀释液。涡旋混合lmin, 4000g离心分离5min。(注:如下层乳化,可将试管置于80°C水浴中5min左右，并再次进行离心)，弃去上层，吸取100 μ L下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数1所述试剂盒曲线灵敏度为0.0125ng/mL。所述试剂盒精密度可达到批内变异系数小于8%，批间变异系数小于20%。所述试剂盒鱼虾样品回收率在87.4--101%。【附图说明】图1-反应时间的选择图2-氯霉素化学发光酶联免疫反应标准曲线图3-试剂盒的直观示意图图中:盒体(1)、酶标板⑵、酶标抗体工作液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种氯霉素的化学发光酶联免疫分析试剂盒，其特征是由(1)包被有包被抗原的微孔板，(2)氯霉素标准品，(3)酶标抗体工作液，(4)缓冲液，(5)洗涤液，(6)发光液组成。
【技术特征摘要】
1.一种氯霉素的化学发光酶联免疫分析试剂盒，其特征是由(I)包被有包被抗原的微孔板，(2)氯霉素标准品，(3)酶标抗体工作液，(4)缓冲液，(5)洗涤液，(6)发光液组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是包被抗原(I)是由氯霉素小分子和载体蛋白(牛血清白蛋白BSA)通过EDC(碳二亚胺)法偶联制成的完全抗原。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是酶标氯霉素抗体(3)该酶标抗体是将辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法与氯霉素抗体连接，形成酶标抗体。4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板(I)，其特征为48孔、96孔或其他孔数的可拆卸或不可拆卸微孔板。5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板，其制备:将包被抗原以包被缓冲液稀释，每孔加入50-300 μ L置于4°C冰箱包被。次日将包被抗原的微孔板取出洗漆后每孔加50-300 μ L封闭液,置于25_40°C水浴锅封闭0.5-2小时后再洗漆,拍干，用真空密封在4°C下保存。6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是发光液(6)，该发光液包含T缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸、过硼酸钠。7.一种用权利要求1所述的试剂盒检测氯霉素的方法，其特征是向微孔板中加入氯霉素标准溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈建军，金伟，崔海容，冯汉利，李娟娟，余浩，曾宪东，
申请(专利权)人：湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，武汉百仕康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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