用于从样品检测细胞的方法技术

一种用于从样品检测细胞的方法，包括以下步骤：（a）将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的一般二维载体，所述载体具有孔，所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或这些细胞的片段的结合分子；（b）使待检测的细胞或这些细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的一般二维载体的孔中，所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中；（c）通过至少一个特异于待检测的细胞或片段的结合分子留住待检测的细胞或片段；（d）通过成像方法在所述一般二维载体上进行光学读出方法，可选地在待检测的细胞或细胞片段已经通过标记剂被标记之后进行；其中（e）被用于读出方法的包括例如透镜系统的光学系统的光轴通常在样品或样品部分的流动的方向上延伸；并且（f）细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的一般二维载体的表面上进行的。

Method for detecting cells from a sample

A method for detecting the samples from the cell, which comprises the following steps: (a) the liquid samples or samples in the direction of flow is applied to the general two-dimensional porous carrier, the carrier has a hole, the hole has the binding molecules on the surface of at least one specific to detect cell or fragments of these cells; (b) to make the detected cells or fragments of these cells from the sample or part of the general two-dimensional vector into the porous holes, the average pore diameter of the hole of the cell or fragment to be detected can enter the hole; (c) cells or fragments by binding molecules at least one specific to detect the cell fragments to be detected or retain; (d) optical readout method in the two-dimensional vector by the imaging method, optionally to be detected in cells or cell fragments Has been through after the marking agent is marked; the (E) is used for readout method including axis optical system lens system such as extending generally in the sample or part of the flow direction; and (f) detection of cells or cell fragments is on the surface of the porous carrier of general two-dimensional on the.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于从样品检测细胞(特别是微生物的)的方法。
技术介绍
复杂的样品溶液中的细胞的定量和定性检测是微生物学、细胞学和现代生物技术的基本操作。在这一方面，食品样品中微生物的快速和直接检测是特别严格的。由于样品基质的可能较高的复杂性，而且就特别相关的细菌(例如沙门氏菌(fe7?we77a)、李斯特菌(Zisieria)或军团杆菌(Iegionella)(饮用水))而言确保无菌性的需要，以及因此的细菌的检出限，它具有高的要求。特别地，食品工业要求一种不需要富集(enrichment)(即微生物的繁殖)的步骤，的方法。提供新的快速并廉价的微生物检测方法是具有很大现实意义的问题。尽管近数十年来，为改善公众健康取得了显著的创新性科学成就，并且传染病减少，但是全世界每年约300万人死于食源性疾病。因此，在死因统计中，与食物相关的感染被发现与AIDS处于相同的水平，并且比肺结核更高。在根据德国食品和饲料法(German Food and Feed Act) (LFGB, 2006)的要求和建议的最近建立的检测方法中，一等分的食物(通常25g)或一研磨海绵样品或从胴体表面和棉签(swabs)穿刺而出的样品,被悬浮在225ml的液体培养基中，从而增加均匀地和部分地污染的食物的检测灵敏度。通过该方法，一方面，细菌被洗脱进培养基，而另一方面，对于培养相关的方法，介质用于激发亚致死性损坏的细菌。这一步骤通常在一个或多个非选择性或选择性的持续数小时的初始富集步骤中进行。假设菌落从每个细菌形成，随后通过将初始培养基接种到营养琼脂平板上进行经典的检测步骤。因此，例如在已建立的微生物肉类检测中，待检测的病原体在一个或多个液体选择性富集介质中进行初步培养24至48小时。在固体培养基(选择性琼脂)培养之后，对细菌进行形态学和表型评估。转移至无抑制剂琼脂之后，菌株最后被进行生化和血清学表征直至食用水平。从样品到达实验室到结果陈述，例如对于单核细胞增生李斯特氏菌iListeria monocytogenes),检测的整个过程需要三天(阴性样品)至五天(阳性样品)。为了实现法例规定，其要求大量额外的中间控制，特别地没有大量延迟，前述采用的技术太慢和太复杂。此外，微生物特定的富集/繁殖发生的所有过程都必须在经当局批准的微生物实验室中进行(德国感染保护法第64款)。食品制造商通常从相关的逻辑学及财务支出回避，并要求快速的方法从而避免上述问题。因此，在过去二十年中进行了许多努力，以发展更快的方法，其中在非选择性初步富集之后，能够不需要形成菌落而进行检测，这可以缩短方法。以下简单地介绍这些方法。核酸检测方法(PCR，RNA杂交，NASBA):作为规则，这包括细胞裂解，随后进行核酸提取、特定核酸目标的扩增和最终检测。对于使用的平均量为1-10 μι的模板，能够达到约为10基因组当量/样品的检出限。由于使用的样品体积通常仅为10-50 μ?，预孵育数个小时之后必须达到IO3至IO4的细菌数量，从而能够确定起始样品的无菌性。免疫测定法(ELISA，免疫层析法):这是基于抗原和其相应的抗体的高度特异结合反应以及随后反应产物的光学检测，该检测通过酶或染料标记的检测抗体结合至先前形成的复合物。免疫测定法需要样品体积约50-200 μ?，检出限约为IO3至IO4 CFU/样品(ELISA)或IO4至IO5 CFU/样品(免疫层析法)。数小时的初始富集步骤在这里是必须的，从而得到这样的细菌数量并且确保起始样品的无菌性。流式细胞术:与荧光共轭物和磁性粒子结合的流式细胞数被应用于食物检测。检出限近似IO3 CFU/ml。因此，该方法不能在没有初始富集的情况下也不能被应用。此外，流式细胞术被应用于血细胞(特别是白细胞)的免疫表型。当被用于微生物学时的相似的方法学缺点如下。约5000个细胞必须被检测，从而得到有效的结果。因为红细胞的大量过剩，对于白细胞，这会导致非常长的检测时间。为避免这一点，在此也必须进行白细胞的初始富集，例如通过浓度梯度的离心来分离白细胞或者通过红细胞的选择性渗透裂解来测定。这些方法是繁琐的，其中一些没有充分的选择性，并导致细胞的流失。 抗体直接荧光过滤技术:在该技术中，微生物的分离是通过体积排阻在表面过滤器上进行的。通常，使用0.45 Mffl的过滤器。通常通过使用活体染料的染色(活/死染色，见下文)进行检测，或者通过免疫荧光共轭。通过该技术，原则上能够达到10-100 CFU/样品的检出限。问题是因为食物成分的颗粒沉积在过滤器上，该方法具有失效的高敏感性。因此，它仅能够被应用于相对干净的样品或者在红细胞成分的分离之后，并且由于其失效的敏感性，其被特别限制为1-10 ml的样品。在专利文献中，已经描述了对这些平台技术的某些特别的设计。因此，EP-A-1 223429描述了一种用于检测活微生物和/或真核细胞(特别是样品中的单细胞生物、霉菌)的方法，其中液体形式的样品被与载体接触，该载体具有特异于将要检测的微生物的受体，所述微生物被结合至受体，并且测定一个表示活微生物的因素。在此描述的方法中的载体包括以模制品形式的柱提供的材料、颗粒形式的松散填料，以琼脂的形式或作为分散体，其携带用于特别地结合待确定的微生物的至少一个受体，并且对流体是可渗透的。载体材料的平均孔径为I至200 μ?,并且孔体积分数为20-80%。该载体材料没有或者仅具有非常低的、非特异的对微生物的吸水性(sorptivity)，并且具有每ml载体IO2至IO18受体的载量。通常通过圆柱形过滤元件或填料在微型柱内进行分析，并且整体检测过滤器上的光学变化。流动的方向和评估的方向相互垂直。该方法达到与上述免疫分析方法相似的检出限。W0-A-2008/118400公开了生长于透明的半透膜上的微生物的群体的快速测定和鉴定。该测定是使用显色指示剂在常规的琼脂平板上完成的。这是一种改进的经典微生物操作方法，允许更有效的操作。W0-A-2004/072097公开了用于HIV诊断的基于微芯片的系统。其中描述的一种方法的变形涉及结合有抗体的核孔膜上的细胞的检测，膜的孔径比待检测的细胞更小。W0-A-91/01485涉及使用定量评价的比色或荧光快速测试。为了检测细胞成分，后者被提取，并且抗原的检测在负载抗体的载体上进行。EP-A-0421235公开了层压至载体结构的亲水膜，以应用于侧向流试纸测试。W0-A-85/05451描述了在多孔固相上进行的三明治检测(sandwich assays)。当检测进行时，固相被沿轴向穿过。多孔膜的孔不是特定的。但是，看上去使用的孔径小于待检测的细胞的尺寸。EP-A-2 317 319提出了用于结合检测的多孔固相，该检测能够使测试样品(例如全血)被迅速、便捷、准确、廉价地分析，而不需要预处理，并公开了使用所述多孔固相的结合测试方法。在加入测试样品之前，至少一种表面活性剂被结合至用于结合测试的多孔固相，所述至少一种表面活性剂选自:(A)包括通式(I)所示化合物的含糖表面活性剂，(B)包括蔗糖脂肪酸酯的含糖表面活性剂，其中构成脂肪酸具有5至14个碳原子，以及(C)甾类表面活性剂。参考文献没有提到待分析的组分的穿透进多孔固相的孔中的重要性。
技术实现思路
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【技术保护点】
一种用于从样品检测细胞的方法，包括以下步骤：（a）将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的、大体为二维的载体，所述载体具有孔，所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或这些细胞的片段的结合分子；（b）使待检测的细胞或这些细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的、大体为二维的载体的孔中，所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中；（c）通过至少一个特异于待检测的细胞或片段的结合分子留住待检测的细胞或片段；（d）通过成像方法在所述大体为二维的载体上进行光学读出方法，可选地在待检测的细胞或细胞片段已经通过标记剂被标记之后进行；其中（e）被用于读出方法的光学系统的光轴大体在样品或样品部分的流动的方向上延伸；并且（f）细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的、大体为二维的载体的表面上进行的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.11 EP 11154137.1;2011.02.11 US 61/441,7731.一种用于从样品检测细胞的方法，包括以下步骤: (a)将液相的样品或样品的部分以流动的方向施加至多孔的、大体为二维的载体，所述载体具有孔，所述孔在其表面具有至少一个特异于待检测的细胞或这些细胞的片段的结合分子; (b)使待检测的细胞或这些细胞的片段能够从样品或样品部分进入所述多孔的、大体为二维的载体的孔中，所述孔的平均孔径使得待检测的细胞或片段能够进入孔中； (c)通过至少一个特异于待检测的细胞或片段的结合分子留住待检测的细胞或片段； (d)通过成像方法在所述大体为二维的载体上进行光学读出方法，可选地在待检测的细胞或细胞片段已经通过标记剂被标记之后进行；其中 Ce)被用于读出方法的光学系统的光轴大体在样品或样品部分的流动的方向上延伸；并且 Cf)细胞或细胞片段的检测是在所述多孔的、大体为二维的载体的表面上进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)和(d)之间，并且在样品或样品的部分已经被施加并且待检测的细胞或细胞片段已经进入孔之后，所述样品载体被可选地洗涤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在被施加至所述多孔的、大体为二维的载体之前或之后，所述样品被进 行样品处理，以标记所述细胞或片段。4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述标记是通过使用染料的染色进行的。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大体为二维...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·亨策，彼得·米尔希，
申请(专利权)人：FZMB医疗技术和生物技术研究中心有限公司，
类型：
国别省市：