本发明专利技术一般地涉及微生物的检测领域，特别是细菌的检测，涉及测量酶活性如DNA聚合酶活性的方法，特别是涉及针对微生物粗裂解物进行的该方法，用于测定可以与扩增信号发生器如实时聚合酶链反应（PCR）技术相关联的微生物酶活性，从而能够测定样品如未纯化的血液和其它体液中的微生物病原体。本发明专利技术还涉及用于该方法的试剂，以及涉及包括用于实施该方法的该试剂的检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法相关申请的交叉引用本申请为非临时申请，将其以引用方式并入本文，并要求提交于2010年4月16日的第61/324,939号美国临时申请、提交于2010年4月16日的第61/324,949号美国临时申请和提交于2010年4月19日的第61/325,413号美国临时申请的部分优先权。专利
本专利技术一般涉及检测微生物的领域，特别是细菌的检测。本专利技术也提供了检测微生物的改进方法，该方法灵敏度高，适用于未纯化的样品，并具有多种用途，以及检测试剂盒，所述检测试剂盒依赖作为细菌生活力的指示剂的连接酶和/或磷酸酶的存在。专利技术背景在许多情况下，测量与细胞生活力相关的某些分子的存在和水平是很重要的。例如，在哺乳动物细胞中测量ATP的水平对于生长分析和毒理学目的是有用的。培养方法可以用于检测少量的细菌，但该技术需要数日完成，尤其当试图检测少量细菌以及当检测生长较缓慢的微生物时。作为另外一种选择，可基于对分子存在的测定进行试验，所述分子的存在与在污染的细胞或生物体的样品中的存在相关。最常检测的分子为三磷酸腺苷（ATP）。虽然死亡后细胞中可变的核酸留存导致DNA和RNA的存在和生活力之间的联系不明确，但也提出了DNA和RNA的检测（Keer&Birch,JournalofMicrobiologicalMethods53(2003)175-183）。也提出了作为生活力指示剂的腺苷酸激酶的检测（SquirrellDJ,MurphyMJ,LeslieRL,GreenJCD:AcomparisonofATPandadenylatekinaseasbacterialcellmarkers:correlationwithagarplatecounts,inBioluminescenceandChemiluminescenceProgressandCurrentApplications.Editedby:StanleyRA,KrickaLJ.JohnWileyandSons;2002和WO96/02665）。通常采用的测定ATP水平的方法涉及生物发光的利用。该方法利用反应的ATP依赖性，在所述反应中发光的荧光素酶催化荧光素的氧化。方法可用于测量相对低浓度的ATP。利用生物发光检测ATP有用的试剂盒可商购得自Roche、NewHorizonsDiagnosticsCorp、Celsis等。然而，生物发光检测存在许多问题。例如，在来自非微生物源的ATP存在下仅检测到微生物ATP可能是个问题。通过使用可以从ATP的非细菌源分离细菌的滤器，在一定程度上解决了该问题，从而提供更加准确的信号。因此，可以看出微生物检测的常规技术存在许多问题。为了进一步解决这样的问题，提出了连接酶的检测，如公开于1996年2月1日的专利申请公开WO/1996/002665中所描述，其公开了用于测定存在于样品中的微生物和/或其细胞内物质的存在和/或量的方法，其特征在于通过将样品与二磷酸腺苷（ADP）混合，测定样品由来自该ADP的样品产生的三磷酸腺苷（ATP）的量，并将如此产生的ATP的量与腺苷酸激酶的存在/或量以及微生物和/或其细胞内物质相关联，来估计样品中的腺苷酸激酶的量，其中在足以允许ADP向ATP最大转化的摩尔浓度的镁离子存在下进行ADP向ATP的转化。所存在的镁的量优选为使得足以为一摩尔ADP提供一摩尔镁，以使所有ADP分子可以与至少一个镁离子相关联。在于2009年1月15日公开的名称为DETECTIONOFMICRO-ORGANISMSBASEDONTHEIRNAD-DEPENDENTDNALIGASEACTIVITY的专利申请公开WO/2009/007719中公开了作为样品中（存活）微生物存在的有用指示剂的连接酶，特别是NAD-依赖性连接酶。连接酶为催化核酸分子连接的酶。连接反应根据所涉及的连接酶需要ATP或NAD+作为辅因子。在本公开中，利用NAD-依赖性连接酶活性作为样品中（存活）微生物存在的指示剂。由于允许该酶的活性用作样品中存活微生物细胞，特别是细菌源的存活微生物细胞的指示剂，NAD-依赖性连接酶活性和生活力之间的联系是在该申请中所公开的专利技术的核心（Korycka-Machala等人,AntimicrobialAgentsandChemotherapy,Aug.2007,第2888-2897页）。然而，在引导本专利技术形成的实验中，发现在该专利申请公开WO/2009/007719中所描述的技术和教导无法应用于未纯化样品中的存活微生物的测定，所述未纯化样品如粗微生物裂解物、血液或血液培养物，从而构成如该参考文献所述技术的主要缺陷。然而，已发现这些方法也有问题。例如，如上述引用的专利申请所公开，已发现当用于其预定的样品类型时（血液衍生的微生物粗细胞裂解物），一般地常规连接酶底物检测设计和其所产生的检测信号无连接酶特异性。这些正是本专利技术所要解决和克服的问题。专利技术概述与上述常规方法相反，在一个方面，本专利技术涉及酶如聚合酶的检测，在优选的实施方案中所述聚合酶为DNA或RNA聚合酶，所述酶作为样品中（存活）微生物或微生物存在的有用指示剂，特别是样品例如粗微生物裂解物或未纯化的血液或血液培养物。根据本专利技术发现的酶活性例如聚合酶活性和微生物（micoorganism）或微生物（microbe）的生活力之间的关联使得这些酶的活性检测可用作样品中存活微生物细胞，特别是细菌来源的存活微生物细胞的指示剂。同样地，本专利技术在一个优选实施方案中提供了用于检测作为样品中微生物存在的指示剂的DNA或RNA聚合酶的方法。该方法可以包括：（a）将样品与核酸分子接触，所述核酸分子用作样品中聚合酶活性的底物；（b）在适合于聚合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和（c）测定由微生物聚合酶作用于底物核酸分子而产生的核酸分子的存在（和/或量）测定，从而指示微生物的存在。此外，本专利技术提供了用于上述方法中的试剂，以及包括该试剂的检测试剂盒以进行该方法。另一个方面，本专利技术提供了于2009年1月15日公开的名称为DETECTIONOFMICRO-ORGANISMSBASEDONTHEIRNAD-DEPENDENTDNALIGASEACTIVITY的专利申请公开WO/2009/007719中所述方法、组合物和试剂盒的改进，所述申请公开识别作为（存活）微生物（micoorganism）或微生物（microbe）存在的有用指示剂的连接酶，特别是NAD-依赖性连接酶。将所述WO/2009/007719包含的整个公开内容以引用方式并入本文，并使其成为本申请的一部分。因此，本专利技术提供了如WO/2009/007719中所公开的检测作为样品中微生物存在的指示剂的酶的方法、组合物和基于其的试剂盒的改进，所述酶选自NAD-依赖性连接酶或磷酸酶或上述的混合物，所述改进的方法包括：（a）将样品与核酸分子接触，同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中酶活性的底物；（b）在适合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和（c）测定由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的酶修饰的核酸分子的存在（和/或量），以指示微生物的存在。因此，应认识到本专利技术的改进的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.16 US 61/324949;2010.04.16 US 61/324939;201.一种用于检测样品中微生物存在的方法，其中聚合酶活性被检测作为所述样品中所述微生物存在的指示剂，所述方法包括：(a)将样品与核酸分子接触，所述核酸分子用作样品中聚合酶活性的底物；(b)在适合于聚合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和(c)特异性测定由微生物聚合酶通过核酸分子的核酸扩增作用于底物而产生的核酸分子的存在和/或量，从而指示微生物的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶为DNA聚合酶或RNA聚合酶。3.根据权利要求1所述的方法，其中所检测的微生物为样品中的存活微生物。4.根据权利要求1所述的方法，其中所检测的微生物为样品中的完整微生物。5.根据权利要求4所述的方法，其中所检测的完整微生物为其中核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖恩·马克·奥哈拉，丹尼尔·R·兹威特泽格，
申请(专利权)人：宙斯科学有限公司，肖恩·马克·奥哈拉，丹尼尔·R·兹威特泽格，
类型：
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