提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法技术

一种提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，包括种子培养和发酵培养，在发酵过程中分段加入由CTTE和DMSO组成的活性剂，并结合阶段控温的方法控制发酵阶段的温度，0-40h设定培养温度为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，在发酵进入到对数生长期时流加0.1%～0.14%的CTTE，到发酵中期流加0.06%～0.1%的DMSO。该方法通过改善细胞膜的通透性，来提高聚苹果酸的产量，同时缩短了发酵周期，聚苹果酸的产量普遍提高了40%，减少了生产成本，提高了生产效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵的
，具体说是一种提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法。
技术介绍
出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属，又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”、“出芽短梗霉”及“短梗霉”，是一种和酵母有密切联系的、具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。利用出芽短梗霉进行发酵能够得到聚苹果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及单细胞蛋白等产物。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸和化学合成法相比，具有成本低、反应条件温和、分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意。表面活性剂是指加入少量能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，具有亲水基和疏水基的离子或非离子化合物。将表面活性剂作为发酵促进剂的研究越来越多。大多数专家认为由于表面活性剂独特的结构特征，使其具有增加细胞膜通透性的作用，从而使代谢产物分泌到细胞外，消除了代谢产物的负反馈作用，完成产物在发酵液中的蓄积，最终达到了提高产率的目的。目前文献当中有关提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法主要是通过菌种诱变以及培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致聚苹r>果酸成本居高不下。还有一些专利是通过改变发酵方式和添加生长因子来提高产量。申请号为201310746941.5的专利技术专利采用添加维生素的方法提高聚苹果酸的合成量，使产量达到45g/L，现有技术中有关添加表面活性剂来提高产物合成的研究比较少。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法。本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:本专利技术的提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，包括以下步骤：(1)种子培养将出芽短梗霉菌株活化2～3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；(2)发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10％(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1:1～1:3，罐压在0.1Mpa，0-40h设定培养温度为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，发酵进行到48h时开始流加发酵体积0.1％～0.14％的CTTE，发酵进行到72h时开始流加发酵体积0.06％～0.1％的DMSO，发酵周期为144h。本专利技术还可以采用以下技术措施：步骤(1)中，种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为蒸馏水。步骤(2)中，发酵培养基为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，KH2PO40.1g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.5g/L，MnSO40.05g/L，其余为蒸馏水。步骤(2)中，流加发酵体积0.12％的CTTE。步骤(2)中，流加发酵体积0.08％的DMSO。步骤(2)中，0-40h设定培养温度为30℃，40h以后调节温度为25℃。出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，已于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种编号CGMCCNo.7055，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。本专利技术具有的优点和积极效果是:本专利技术的提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法中，加入由CTTE和DMSO组成的活性剂，并结合阶段控温的方法控制发酵阶段的温度，0-40h设定培养温度为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，在发酵进入到对数生长期时流加0.1％～0.14％的CTTE，到发酵中期流加0.06％～0.1％的DMSO。该方法通过改善细胞膜的通透性，来提高聚苹果酸的产量，同时缩短了发酵周期，聚苹果酸的产量普遍提高了40％，减少了生产成本，提高了生产效率。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。本专利技术的提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，包括以下步骤：(1)种子培养将出芽短梗霉菌株活化2～3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10％的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；(2)发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10％(v/v)的量接于装有3L发酵液的5L发酵罐中进行发酵培养。初始转速300r/min，通风比1:1～3，罐压在0.1Mpa，0-40h设定培养温度为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，发酵进行到48h时开始流加发酵体积0.1％～0.14％的CTTE，发酵进行到72h时开始流加发酵体积0.06％～0.1％的DMSO，发酵周期为144h。对发酵液进行聚苹果酸测量的步骤包括：聚苹果酸的粗提：发酵液离心除菌体后，加入4倍体积的无水甲醇，搅拌离心去除上清后，再使用蒸馏水冲洗2遍，沉淀烘干即为聚苹果酸粗品。聚苹果酸的测定：本专利使用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定，首先将含有聚苹果酸且去除菌体的发酵液水解，用高效液相色谱法测定其中苹果酸的含量，从而得出聚苹果酸的产量。本专利技术所用菌种来源:天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号:200910071171.2。该专利中公开了本专利技术所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，保藏于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种编号CGMCCNo.7055。步骤(1)中，种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆0.1v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g\本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，包括以下步骤：（1）种子培养将出芽短梗霉菌株活化2～3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；（2）发酵培养接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1:1～1:3，罐压在0.1Mpa，0‑40h设定培养温度为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，发酵进行到48h时开始流加发酵体积0.1%～0.14%的CTTE，发酵进行到72h时开始流加发酵体积0.06%～0.1%的DMSO，发酵周期为144h。

【技术特征摘要】
1.一种提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，包括以下步骤：
（1）种子培养
将出芽短梗霉菌株活化2～3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的孢子，制备孢子悬液，
按照10%的接种量将孢子悬液转接到含有100ml种子培养基的500ml的挡板瓶中进行培养，
培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h；
（2）发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐
中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1:1～1:3，罐压在0.1Mpa，0-40h设定培养温度
为25～35℃，40h以后调节温度为20～30℃，发酵进行到48h时开始流加发酵体积0.1%～
0.14%的CTTE，发酵进行到72h时开始流加发酵体积0.06%～0.1%的DMSO，发酵周期为144h。
2.根据权利要求1所述的提高出芽短梗霉合成聚苹果酸产量的方法，其特征在于：步骤
（1）中，种子培养基组成为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵1g/L，丁二酸2g/L，玉米浆
0.1v/v，K2CO30.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2P...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，边艳慧，李雪，范栩嘉，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12