用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法技术

本发明专利技术为用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法。为了在pH受控的分批发酵中在矿物盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸，构建了经遗传改造的微生物，但不添加质粒或外源基因。本发明专利技术还提供了生产琥珀酸和苹果酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请为2008年3月19日提交的，专利技术名称为"用于有效生产琥珀酸和苹果酸的 材料和方法"的PCT申请PCT/US2008/057439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段 的日期为2009年9月18日，申请号为200880008975. 1。 与相关申请交叉参考 本申请主张2007年3月20日提交的美国临时申请系列号No. 60/895, 806的权益， 其公开内容通过整体引用作为参考，包括所有的图、表格和氨基酸或核酸序列。 政府支持 根据授权号USDOE-DEFG02-96ER20222 下由能源部（D印artmentofEnergy) 授权的，和授权号USDA&DOEBiomassRDIDEFG36-04G014019下由能源部与美国农业部 (UnitedStatesDepartmentofAgriculture)联合授权的政府支持，完成了本专利技术。政府 对本专利技术具有某些权利。 专利技术背景 随着石油价格的提高，从可更新的原料发酵生产琥珀酸会越来越有竞争力。琥珀 酸可作为底物用于转化成塑料、溶剂和目前由石油制成的其他化学品（Lee等，2004;Lee 等，2005;McKinlay等，2007;Wendisch等，2006;Zeikus等，1999)。许多细菌被描述为具有 生产琥珀酸作为主要发酵产物的天然能力（美国专利号No. 5, 723, 322;表1)。然而，通常 需要复杂的工艺、复杂的培养基和长久的孵育时间。 先前已使用多种遗传手段改造大肠杆菌菌株（Escherichiacoli)用于生产琥泊 酸，并取得了不同程度的成功（表1)。在大部分研宄中，达到的滴度较低，并且需要复杂 的培养基成分例如酵母提取物或玉米浆。菌株NZN111以每摩尔被代谢的葡萄糖0.98摩 尔瑭I自酸的摩尔产率生产108mM瑭I自酸（Chatterjee等，2001 ;Millard等，1996;Stols 和Donnelly，1997)。该菌株如下改造得到：使两个基因失活（编码丙酮酸-甲酸裂解酶 的pflB和编码乳酸脱氢酶的ldhA)并过表达来自多拷贝质粒的两个大肠杆菌基因：磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶（ppc)和苹果酸脱氢酶（mdh)。菌株HL27659k如下改造得到：突变琥 I白酸脱氢酶（sdhAB)、磷酸乙酰转移酶（pta)、乙酸激酶（ackA)、丙酮酸氧化酶（poxB)、葡 萄糖转运蛋白（ptsG)和异柠檬酸裂合酶阻抑物（iclR)。该菌株生产少于100mM的琥珀 酸并需要氧受限制的发酵条件（Cox等，2006 ;Lin等，2005a，2005b，2005c;Yun等，2005)。 使用在计算机芯片上的代谢分析设计基因敲除，从而在大肠杆菌中创建与Mannheimia succiniciproducens中的天然琥泊酸途径相似的途径（Lee等，2005和2006)。然而得到的 菌株生产非常少的琥珀酸。Andersson等，（2007)报道了仅含有天然基因的经改造的大肠 杆菌琥珀酸生产的最高水平（339mM)。 其他研宄人员从事的是在大肠杆菌中表达异源基因的备选途径。从多拷贝质粒中 过表达Rhizobiumeteloti丙酮酸羧化酶（pyc)，从而指导碳流向琥I自酸（Gokarn等，2000 ; Vemuri等，2002a，2002b)。如下构建菌株SBS550MG:使异柠檬酸裂合酶阻抑物（iclR)、 adhE、ldhA和ackA失活，并从多拷贝质粒中过表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)的 citZ(朽1檬酸合酶）和R.etlipyc(Sanchez等，2005a)。使用该菌株，以1. 6的摩尔产率从 葡萄糖生产160mM琥珀酸。 也研宄了用于琥珀酸生产的更复杂的工艺（表1)。许多这些工艺包括需氧生 长期，之后是厌氧生产期。厌氧期通常用二氧化碳、氢或二者提供（Andersson等，2007;Sanchez等，2005a和 2005b;Sanchez等，2006 ;美国专利号 5, 869, 301;Vemuri等，2002a和 2002b)。在使用天然琥I自酸生产者产琥I自酸厌氧螺菌（A.succiniciproducens)的近期研 宄中，组合了电渗析、C02的喷射、细胞再循环和分批补料（Meynial-Salles等，2007)。 本专利技术提供了在矿物盐培养基中，在简单的、pH-受控的、分批发酵期间，以高滴度 和产率生产琥珀酸而不需要异源基因或质粒的多种形式的微生物，例如大肠杆菌菌株。在 开发期间，中间体菌株的特征是生产苹果酸作为优势产物。 专利技术概述 本专利技术提供了适用于生产乳酸的新微生物，例如大肠杆菌。因此，本专利技术的材料和 方法可被用于生产适用于多种应用的琥珀酸和苹果酸。 在某些实施方案中，大肠杆菌的衍生物（在本文中也称作大肠杆菌）可被用于构 建生产琥珀酸、苹果酸和丙氨酸的菌株。在多种实施方案中，大肠杆菌C(例如ATCC 8739) 可同大肠杆菌的任何其他菌株一样被使用，所述任何其他大肠杆菌菌株可得自多种保藏单 位或商业来源。在一些实施方案中，本专利技术的经改造的微生物也仅含有天然基因（即不含 有来自其他生物的遗传材料）。根据下文的描述会容易地明了本专利技术的其他优点。 附图概沐 图1A-1B.葡萄糖成为琥珀酸的发酵。图1A显示通过大肠杆菌发酵葡萄糖的标准 途径。该途径已由Unden和Kleefeld(2004)重新画出。粗体箭头表示中枢发酵途径。十字 代表为了改造KJ012在该研宄中进行的基因缺失（ldhA，adhE，ackA)。基因和酶：ldhA，乳酸 脱氢酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA， 乙酸激酶；adhE，醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA， 梓檬酸合酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索 酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异朽1檬酸脱氢酶；acs，乙酰基~CoA合成酶；mgsA，甲基 乙二醛合酶；P〇xB，丙酮酸氧化酶；aldA，醛脱氢酶；和aldB，醛脱氢酶。图1B显示经改造的 大肠杆菌菌株中，ATP生产和生长与琥珀酸和苹果酸生产的偶合。实线箭头连接NADH池。 虚线箭头连接NAD+池。在厌氧条件下的糖酵解期间，生长与ATP的生产和NADH的氧化专 性偶合。 图2A-2D.大肠杆菌对琥珀酸生产的可能的羧化途径。编码关键性羧化酶的基因 以粗体显示。图2A显示PEP羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸（PEP)不生产ATP。这被认为是葡萄 糖发酵期间大肠杆菌生产琥珀酸的主要途径。 图2B显示苹果酸酶（NADH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP 期间，能量被保存。苹果酸酶（sfcA)催化NADH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图 2C显示苹果酸酶（NADPH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP期间，能 量被保存。苹果酸酶（maeB)催化NADPH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图2D显示 PEP羧激酶（carboxykinase)。在PEP的羧化期本文档来自技高网...

【技术保护点】
经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞产生至少200mM琥珀酸并且包含对以下靶基因的遗传修饰：a)ldhA，b)ack，c)adhE，和d)focA‑pflB，所述遗传修饰使所述靶基因编码的多肽的酶活性失活。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·扬塔玛，M·J·豪普特，X·张，J·C·穆尔，K·T·尚穆加姆，L·O·因格拉姆，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：美国;US