一种抗人肺癌干细胞的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人肺癌干细胞的单克隆抗体。具体地，本发明专利技术涉及一种新的能特异识别、并能抑制人肺癌干细胞的单克隆抗体，及其生产的杂交瘤细胞系，以及该抗体在制备可用于治疗人肺癌复发药物中的应用。该单抗体外可以显著抑制人肺癌干细胞的自我更新、侵袭、迁移，体内显著抑制人肺癌移植瘤的生长和复发，延长荷瘤小鼠的生存期。本发明专利技术还提供了保藏号为CGMCC No.10898该单克隆抗体的生产细胞系小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗人肺癌干细胞的抗体及其生产的杂交瘤细胞系，以及该抗体在治疗肺癌生长和复发中的应用。具体而言，本专利技术提供了一种可与人肺癌干细胞天然膜抗原结合的单克隆抗体，及其在制备可用于治疗人肺癌的药剂中的应用。
技术介绍
肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位，且呈上升趋势。尽管肺癌的临床诊断和治疗较以前有了很大进步，但手术切除无力于大部分的多发、转移或复发的肺癌，而相当数量的病人对化疗药物产生耐药，放疗受到胸腔重要脏器的限制，因此现有的三大治疗手段治疗肺癌的效果仍不理想，5年生存率仍然很低。已有的研究表明肺癌组织和细胞系中存在有肿瘤干细胞，它们具有自我更新和不定向分化潜能，能被诱导分化、高运动侵袭性、抵抗放化疗和高致瘤性等生物学特性。目前临床的肿瘤治疗手段，如手术切除、放化疗、靶向治疗癌细胞的生物治疗，均不能有效杀灭和清除肿瘤干细胞，最终导致抵抗放化疗的肿瘤干细胞反而被筛选富集，比例大大提高，迅速生长，扩散、转移至全身各器官继续分化形成新的转移病灶，进而导致肿瘤的转移复发和耐药，因此靶向肿瘤干细胞治疗有望治疗肿瘤的转移复发，延长生存期改善预后，成为目前肿瘤研究的新热点。肿瘤靶向药物主要包括小分子化学药、蛋白多肽药、基因治疗药和单抗药物等，目前在临床上广泛应用的主要是单抗药物和少数几种小分子药物，现已有10余种肿瘤靶向抗体药物上市在临床应用。十几年的临床应用结果表明，单抗药物选择性强，临床疗效显著，安全有效，在靶向药物中具有明显优势，而且其规模化生产技术也已成熟，因此成为靶向治疗生物药物开发的首选，这些也决定了研发靶向肿瘤干细胞的靶向药物，单抗药物是首选品种。目前有关靶向肿瘤干细胞的抗体药物仍未见报道。
技术实现思路
因此，为了克服现有临床治疗现状及抗肺癌抗体药物研发中的不足，本专利技术提供一种单克隆抗体，其由于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏号为CGMCCNo.10898的小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6产生。所述的单克隆抗体为小鼠IgG1型单克隆抗体。本专利技术还提供一种由保藏号为CGMCCNo.10898的小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6产生的单克隆抗体在制备用于治疗人肺癌生长和复发的药物中的应用。本专利技术还提供一种小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6的杂交瘤细胞株，其于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏号为CGMCCNo.10898其特征在于分泌产生如权利要求1所述的单克隆抗体。换言之，本专利技术的第一个方面在于提供一种新的能与人肺癌干细胞结合，并可在体内抑制肺癌生长和复发的单克隆抗体，该抗体在体外具有抑制人肺癌干细胞的自我更新、侵袭和迁移，在体内可以显著抑制肺癌荷瘤小鼠的生长和复发。目前，国内外尚未关于抗肺癌干细胞单抗抑制肺癌生长和复发的报道。本专利技术的第二个方面在于提供上述单克隆抗体在制备可用于治疗人肺癌及其转移的药剂中的应用。本专利技术的第三个方面在于提供可分泌产生上述单克隆的小鼠杂交瘤细胞系。根据本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了一种新的抗人肺癌干细胞的单克隆抗体。使用该单克隆抗体，可在体外抑制人肺癌干细胞的自我更新、侵袭、迁移，体内抑制肺癌组织的生长和复发。首先，本专利技术提供的新的抗人肺癌干细胞的单克隆抗体可用于治疗肺癌的生长和复发。通过将该单克隆抗体以适宜的注射方式，例如静脉注射、腹腔注射等方式注射入机体内，使其进入血液循环扩散至全身，该单克隆抗体可特异识结合肺癌干细胞发挥生物学功能，抑制肺癌干细胞的自我更新、迁移、侵袭，从而抑制体内肺癌生长，从而达到治疗肺癌并抑制复发的作用。根据本专利技术的一个实施方式，本专利技术提供的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6(保藏号CGMCCNo.10898)分泌产生，而该杂交瘤细胞系是由融合小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫人肺癌组织中分离获得的人肺癌细胞来源的单细胞的小鼠的脾细胞融合后经筛选、鉴定获得的。具体地，采用酶消化法和原代结合短暂传代培养从人肺癌组织中分离含人肺癌干细胞的连续传代细胞，在无血清培养基中悬浮成球培养富集。将该细胞洗涤固定后免疫正常BALB/c小鼠。采用间接免疫荧光实验监测免疫小鼠抗血清中的抗人肺癌干细胞的滴度，待特异性抗体滴度超过1:50000后冲击免疫一次，3天后处死小鼠，取脾制备单细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用甲基纤维素平板法制备抗肺癌干细胞单克隆抗体库。待克隆生长后将其分别挑取至96孔板培养。将肺癌干细胞接种于96孔板，用无血清培养基培养30小时后，采用细胞免疫荧光双染色法，检测单抗库中杂交瘤单抗上清与人肺癌干细胞的反应，筛选出识别肺癌干细胞。以流式细胞术检测杂交瘤单抗识别的抗原与肿瘤干细胞标志物CD133在人肺癌干细胞中的表达情况。裸鼠致瘤实验检测单抗所识别细胞的裸鼠致瘤能力。ELISA鉴定单克隆抗体的类和亚类。根据本专利技术的提供的多个实施方式，能够识别肺癌干细胞的克隆被进一步采用CCK-8测定法，检测单抗库中杂交瘤单抗上清对人肺癌干细胞增殖的影响；采用包被Matrigel基质的Transwell小室侵袭实验，检测单抗对肺癌干细胞侵袭能力的影响；采用肿瘤干细胞成球培养法，将人肺癌干细胞接种于无血清培养基中进行成球培养，检测杂交瘤单抗对肺癌干细胞成球能力的抑制作用。采用动物体内致瘤实验，进一步证明杂交瘤单抗能够识别肺癌干细胞。采用抗体治疗实验，证明单抗对移植瘤生长及生存期的影响。根据本领域公知的知识可以判断，由于肿瘤干细胞是肿瘤生长和复发的根源，因而可以推知杂交瘤细胞系LC-5A6产生的单克隆抗体将可能在体内治疗肺癌生长和复发中具有显著作用。进一步，采用仅含杂交瘤细胞系LC-5A6产生的单克隆抗体的PBS溶液注射入荷有人肺癌移植瘤的小鼠体内进行靶向肺癌干细胞的单抗治疗实验，观察其治疗肺癌的疗效，探讨靶向肺癌干细胞是否能治疗肺癌的生长和复发，以期为靶向肺癌干细胞治疗肺癌提供有应用价值的候选单抗药物，且为设计靶向肿瘤干细胞的抗体治疗方案提供科学的实验依据。LC-5A6单抗靶向肺癌干细胞治疗肺癌的动物体内实验研究结果显示，高剂量、中剂量、组LC-5A6抗体在裸鼠体内能够明显抑制人肺癌移植瘤的生长，高、中、低三个剂量组的抑制率分别是75.0％、43.4％和16.3％，实验组与对照组相比，移植瘤体积均有显著差异(P<0.05)。经过20周对高剂量治疗组及对照组的观察发现，抗体治疗可以明显延长裸鼠的生存期。这些结果表明LC-5A6单抗靶向肺癌干细胞，不仅能明显抑制肿瘤生长，而且还能治疗肺癌的复发。因此，本专利技术提供了一种新的抗肺癌干细胞的单克隆抗体，该单克隆抗体可在体内抑制肺癌的生长和复发。本专利技术涉及的单克隆抗体的优越之处在于：1)抑制肺癌干细胞这一与肺癌生长和复发移密切相关的肿瘤细胞。具有上述作用的单抗尚未见到报道。2)可在动物模型的体内抑制人肺癌的生长和复发。3)由自行制备的小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6(保藏号CGMCCNo.10898)分泌产生，并非产生自已有的杂交瘤细胞系。根据本专利技术的第二个方面，本专利技术提供了由上述单克隆抗体在制备可用于治疗人肺癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体，其由于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10898的小鼠杂交瘤细胞系LC‑5A6产生。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其由于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.10898的小鼠杂交瘤细胞系LC-5A6产生。2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体为小鼠IgG1型单克隆抗体。3.一种如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙力超，杨治华，冉宇靓，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11