一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用。一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。本发明专利技术还公开了利用该菌制备液体微生物菌剂的方法以及它们在防治甜瓜根腐病上的应用。本发明专利技术首次发现的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在低浓度下能够有效抑制腐皮镰孢菌的生长，且杀菌应用范围广，对黄瓜根腐病、番茄根腐病等均具有防治效果。

Bacillus cereus for preventing and controlling root rot of melon and its cultivation method and Application

The invention relates to a Bacillus cereus for preventing and controlling root rot of melon and its cultivation method and application. A strain of prevention and control of root rot of muskmelon Bacillus cereus (Bacillus cereus) January 7th NY32016 preserved in general microbial culture collection center, China Management Committee address: Beijing City, Chaoyang District No. 1 Beichen West Road, No. 3 hospital China Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences, No. CGMCC NO.11962 geneticstock. The invention also discloses a method for preparing the liquid microbial inoculum by using the bacteria and the application of the method in the prevention and treatment of the root rot disease of melon. Bacillus cereus was first discovered in the invention (Bacillus cereus) NY3 can effectively inhibit Fusarium solani under low concentration of growth, sterilization and a wide range of applications, has control effect on cucumber root rot, tomato root rot disease.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用，属于植物病害生物防治

技术介绍
根腐病是甜瓜的常见病，以分苗或定植后缓苗前较为常见，危害严重。其病原菌主要为瓜类腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)，病菌以厚垣孢子、菌丝体或菌核在土壤中及病残体上越冬，厚垣孢子可在土壤中存活5-10年。厚垣孢子为引起发病的主要侵染源，病菌从根部伤口侵入，发病后在病部产生分生孢子，借雨水或浇水传播蔓延，进行重复侵染，一旦发生很难治愈。长期以来，该病害的田间防治主要依赖化学杀菌剂，随着咯菌腈、苯并咪唑类化学药剂的大量使用，腐皮镰孢菌已经对该类杀菌剂产生了抗药性，使得防效下降。病原菌的潜伏侵染会造成甜瓜反复染病，这些都影响农产品的品质及危害人和动物的健康，制约高产高效农业的发展。随着人们对环境保护和食品安全越来越重视，研发更加安全、环保的根腐病防治新技术，如生物防治，显得更加迫切。蜡样芽孢杆菌是一种芽孢杆菌，在其自身生长繁殖过程中可以产生一系列具有抗菌活性的代谢产物，能够抑制有害微生物的繁殖，抑制镰刀菌、立枯丝核菌等病原真菌。代谢过程中产生蛋白酶等多种活性酶类，能够降解土壤中的营养成分，改善生态环境，促进作物生长。蜡样芽孢杆菌的芽孢具有较强的耐热、耐盐等抗逆性，在发酵工艺、剂型加工、贮存、定殖、繁殖等方面与其他芽孢杆菌相比具有无可比拟优势。目前国内外对芽孢杆菌的研究比较多，市场上的芽孢杆菌菌剂有粉剂、颗粒、液体，体菌剂产品大都达不到质量标准要求，尤其是国内的液体菌剂产品良莠不齐，菌株功能较差甚至根本没有功效，退化严重或活菌数不达标，保质期达不到要求。固体剂型虽然解决了产品货架期问题，但是固体菌剂的加工工艺使得菌体的多数代谢产物加工过程中失活或被丢弃，造成了环境污染和资源浪费，且增加了生产成本。中国专利文献CN101357857 A(申请号200810013122.9)公开了一种用于水产养殖水稻田的生物有机肥料及其生产方法。肥料包含下列重量份的原料加工制成：牛磺酸0.3～0.5份，吸水链霉菌2～3份，金产色链霉菌2～3份，蜡样芽孢杆菌2～4份，球形芽孢杆菌2～4份，胶冻样芽孢杆菌9～13份，褐球固氮菌2～3份，细黄链霉菌2～3份，水果废渣降解物10份，基质10份，土壤46.5～57份。中国专利文献CN104988098A(申请号201510455413.3)公开了一株防治甜菜根腐病并且促进甜菜生长的芽孢杆菌菌株。该专利技术所提供的防治甜菜根腐病并且促进甜菜生长的芽孢杆菌菌株是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LHTYBA，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7566。田间实验证明，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LHTYBA对甜菜根腐病的防治效果可达86.7％，可使甜菜增产46.00％。但是该专利技术所指甜菜根腐病主要是立枯丝核菌和尖刀镰孢菌，对瓜类腐皮镰孢菌没有防治作用。因此分离制备对瓜类腐皮镰孢菌具有特定生防功能的蜡样芽孢杆菌菌株并研究其液体菌剂配方工艺，用于研制甜瓜根腐病专用型液体菌剂，快速降低土壤中根腐病原菌数量。对于生产高活性、长货架期的液体生防菌剂产品，降低菌剂生产成本、资源的高效综合利用以及有效控制甜瓜根腐病的危害具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用。本专利技术的技术方案如下：一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3的培养方法，步骤如下：(1)将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在LB平板培养基上活化培养，制得活化菌株；(2)将步骤(1)制得的活化菌株转接至LB液体培养基中经种子培养，制得种子液；(3)将步骤(2)制得的种子液按体积比0.5％～3.0％的比例接种于发酵培养基中，经发酵培养，制得蜡样芽孢杆菌NY3发酵液。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的LB平板培养基，每升组分如下：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉15～20g，水定容至1000mL，pH值为7.2.根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的活化培养，温度为35～38℃，时间为18～24h。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的LB液体培养基，每升组分如下：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，水定容至1000mL，pH值为7.2。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中种子培养，温度为32～37℃，时间为16～24h。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中发酵培养基，每升组分如下：葡萄糖20～30g，玉米浆干粉11～18g，黄豆粉15～40g，酵母浸膏1～2g，磷酸二氢钾0.1～0.3g，氯化钠0.1～0.2g，硫酸镁0.1～0.2g，水定容至1000mL，pH值为7.3。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中发酵培养，温度为32～37℃，摇床转速为170～210rpm，时间为30～42h。一种防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，组分如下，均为重量百分比：蜡样芽孢杆菌NY3发酵液10～30％，生化黄腐酸钾3.0～10.0％，甘油5.0～10.0％，硝酸钾6.0～12.0％，尿素2.0～6.0％，蔗糖1.0～3.5％，海藻酸钠0.05～0.01％，硼酸0.5～1.5％，半乳糖0.2～1.2％，无菌水余量。上述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的制备方法，步骤如下：按比例将蜡样芽孢杆菌NY3发酵液与无菌水混合，然后加入生化黄腐酸钾、甘油、硝酸钾、尿素、蔗糖、海藻酸钠、硼酸、半乳糖，混合均匀，即得。上述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的施用方法，步骤如下：定苗后12～15天时开始冲施防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，每亩用量3～5L/次，每隔18～22天冲施一次，在初花期至拉秧期施用3～5次，即可。有益效果1、本专利技术首次发现的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在低浓度下能够有效抑制腐皮镰孢菌的生长，且杀菌应用范围广，对黄瓜根腐病、番茄根腐病等均具有防治效果；2.本专利技术的液体农用微生物菌剂用于防治由病原真菌引起的甜瓜根腐病，病原真菌为瓜类腐皮镰孢菌，该液体农用微生物菌剂抗瓜类腐皮镰孢菌专一性强、功效稳定，具有较长货架期、高活性菌株、活菌量达到1×109CFU/ml；3.本专利技术的蜡样芽孢杆菌生防液体菌剂对作物具有明显促生作用，并使甜瓜发病率和严重度分别下降了69％～73％和91％～95％。附图说明图1-A为本专利技术实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3的菌落形态照片；图1-B为本专利技术实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3的芽孢形态照片；图1-C为根据16S rDNA序列获得的蜡样芽孢杆菌NY3菌株的系统发育树图；图2-A为本专利技术实施例3的蜡样芽孢杆菌NY3对腐皮镰孢菌的抑菌作用结果照片；其中：左图为对照，右图为涂布蜡样芽孢杆菌NY3；图2-B为本专利技术中实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3对尖刀镰孢菌的抑制作用结果照片。具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。

【技术特征摘要】
1.一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3的培养方法，其特征在于，步骤如下：（1）将蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3在LB平板培养基上活化培养，制得活化菌株；（2）将步骤（1）制得的活化菌株转接至LB液体培养基中经种子培养，制得种子液；（3）将步骤（2）制得的种子液按体积比0.5%～3.0%的比例接种于发酵培养基中，经发酵培养，制得蜡样芽孢杆菌NY3发酵液。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的LB平板培养基，每升组分如下：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉15～20g，水定容至1000mL，pH值为7.2；优选的，所述步骤（1）中的活化培养，温度为35～38℃，时间为18～24h。4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的LB液体培养基，每升组分如下：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，水定容至1000mL，pH值为7.2。5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子培养，温度为32～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢芳芳，高明夫，胡兆平，范玲超，滕美丽，
申请(专利权)人：金正大生态工程集团股份有限公司，菏泽金正大生态工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37