一种提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的方法和用途。通过来弱化宿主菌中sucC、talB等72个基因的表达，显著提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的产量，最高产量提高率可达到60％以上。红霉素是目前聚酮类化合物生物合成研究最为清楚的模式化合物，本发明专利技术的生产菌株能够实现发酵过程中红霉素前体6-脱氧红霉内酯(6-dEB)的大量积累，为大肠杆菌异源合成红霉素的工业生产奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于合成生物学和工业生物
，具体地说，本专利技术涉及一种提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的方法和用途。
技术介绍
天然产物在药物开发和发现过程中发挥重要作用。近十几年来，研究者使用异源合成天然产物表现出巨大的潜力。聚酮类化合物(Polyketids)的异源生物合成是目前合成生物学领域中研究较为深入、进展迅速的一个分支。Donadio于1991年提出了6-脱氧红霉素内酯B的合成模型，红霉素的聚酮合酶(PKS)研究因此而成为I型PKS的典范。红霉素生物合成分两个部分：第一是红霉素的母核6-脱氧红霉内酯B(6-deoxyerythronolide-B，6-dEB)的形成；第二是6-dEB侧链糖基化合成红霉素。6-dEB是红霉素合成过程中可分离出来的第一个中间体，合成6-dEB起始原料为丙酸和甲基丙二酸。整个过程由聚酮合酶催化完成。工程化的思想促使科研工作者构建一个工程菌进行异源合成天然产物。由于大肠杆菌代谢网络研究最为深入，因此大肠杆菌常作为工程菌的底盘细胞。2001年，Pfeifer等人利用大肠杆菌异源合成了红霉素第一个前体6-dEB，开启了异源生物合成红霉素的先河。以后的研究者通过大肠杆菌高效获得红霉素也做了诸多的尝试，如为了提高质粒稳定性，Murli等2003年用pccB和pccA基因整合到E.coli编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶ygfG位点，同时用RSF1010的复制起始位点替换pET28a来源于pBR322的起始位点，将pBP144改造为pKOS207-129，获得工程菌株K207-3/pKOS207-129/pBP130在摇瓶中可以获得22.5mg/L的6-dEB。为了提高宿主本身的稳定性，王勇等将红霉素聚酮合酶基因eryAI，AII，AIII通过染色体重组Red/ET方法整合入大肠杆菌染色体上，获得了染色体修饰的稳定菌株，与多个质粒共表达相比，该菌株可稳定的合成红霉素中间体6-dEB。尽管最近十几年中，以红霉素为代表的聚酮类化合物在大肠杆菌中的异源合成取得了一系列重大的进展，并在大肠杆菌中成功的合成了红霉素A。但仍存在着许多问题，如与原产株红霉糖多胞菌相比，红霉素在大肠杆菌中的产量过低。蒙海林等在2011年利用in silico分析研究平台对E.coli的代谢网络进行分析后发现目前大肠杆菌合成聚酮化合物的实际产量仅为理论产量的1/10左右，这说明异源的聚酮化合物合
成途径受大肠杆菌全局网络的调控。因此，对大肠杆菌进行全局网络改造，有可能进一步提高其异源合成聚酮化合物的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高大肠杆菌异源合成聚酮类化合物的方法和用途。在本专利技术的第一方面，提供一种促进合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌生物合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的方法，所述方法包括：(1)在合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌中，弱化靶基因表达；其中，所述的靶基因选自：(a)核苷酸合成和其它代谢模块基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途径模块基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循环和氧化磷酸化模块基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代谢模块基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前体代谢模块基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代谢模块基因靶点fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白质合成代谢模块基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA；或(h)frdD+sucC组合、lsrC+frdD组合、lsrC+sucC组合、frdD+rpiA组合、talA+guaB组合或zwf+guaB组合；(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生物合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯。在一个优选例中，在合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌中，弱化靶基因表达包括：引入抑制靶基因表达的干扰分子或敲除靶基因。在另一优选例中，所述的抑制靶基因表达的干扰分子针对(或自身具有)：sucC中SEQ ID NO:37所示的序列或其互补序列、tdcD中SEQ ID NO:2所示的序列或其互补序列、scpB中SEQ ID NO:3所示的序列或其互补序列、scpA中SEQ ID NO:4所示的序列或其互补序列、ybiW中SEQ ID NO:5所示的序列或其互补序列、pflB中SEQ ID NO:6所示的序列或其互补序列、tdcE中SEQ ID NO:7所示的序列或其互补序列、pflD中SEQ ID NO:8所示的序列或其互补序列、paaF中SEQ ID NO:9所示的序列或其互补序列、fadJ中SEQ ID NO:10所示的序列或其互补序列、fadB中SEQ ID NO:11所示的序列或其互补序列、ackA中SEQ ID NO:12所示的序列或其互补序列、pta中SEQ ID NO:13所示的序列或其互补序列、leuD中SEQ ID NO:14所示的序列或其互补序列、leuC中SEQ ID NO:15所示的序列或其互补序列、yjiM中SEQ ID NO:16所示的序列或其互补序列、purT中SEQ ID NO:17所示的序列或其互补序列、dhaK1中SEQ ID NO:18所示的序列或其互补序列、dhaK2中SEQ ID NO:19所示的序列或其互补序列、dhaH中SEQ ID NO:20所示的序列或其互补序列、ptsH中SEQ ID NO:21所示的序列或其互补序列、ptsI中SEQ ID NO:22所示的序列或其互补序列、fsaA中SEQ ID NO:23所示的序列或其互补序列、ppk中SEQ ID NO:24所示的序列或其互补序列、aceF中SEQ ID NO:25所示的序列或其互补序列、cyoA中SEQ ID NO:26所示的序列或其互补序列、frdD中SEQ ID NO:30所示的序列或其互补序列、frdA中SEQ ID NO:31所示的序列或其互补序列、pgi中SEQ ID NO:32所示的序列或其互补序列、sdhA中SEQ ID NO:33所示的序列或其互补序列、sdhB中SEQ ID NO:34所示的序列或其互补序列、sdhC中SEQ ID NO:35所示的序列或其互补序列、sdhD中SEQ ID NO:36所示的序列或其互补序列、sucD中SEQ ID NO:38所示的序列或其互补序列、tnaA中SEQ ID NO:39所示的序列或其互补序列、glcF中SEQ ID NO:40所示的序列或其互补序列、glcE中SEQ ID NO:41所示的序列或其互补序列、yaeR中SEQ ID NO:42所示的序列或其互补序列、lsrC中SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进合成聚酮类化合物6‑脱氧红霉内酯的宿主菌生物合成聚酮类化合物6‑脱氧红霉内酯的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在合成聚酮类化合物6‑脱氧红霉内酯的宿主菌中，弱化靶基因表达；其中，所述的靶基因选自：(a)核苷酸合成和其它代谢模块基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途径模块基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循环和氧化磷酸化模块基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代谢模块基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前体代谢模块基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代谢模块基因fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白质合成代谢模块基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA；或(h)frdD+sucC组合、lsrC+frdD组合、lsrC+sucC组合、frdD+rpiA组合、talA+guaB组合或zwf+guaB组合；(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生物合成聚酮类化合物6‑脱氧红霉内酯。...

【技术特征摘要】
2014.07.16 CN 20141033873891.一种促进合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌生物合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌中，弱化靶基因表达；其中，所述的靶基因选自：(a)核苷酸合成和其它代谢模块基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途径模块基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循环和氧化磷酸化模块基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代谢模块基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前体代谢模块基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代谢模块基因fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白质合成代谢模块基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA；或(h)frdD+sucC组合、lsrC+frdD组合、lsrC+sucC组合、frdD+rpiA组合、talA+guaB组合或zwf+guaB组合；(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生物合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌中，弱化靶基因表达包括：引入抑制靶基因表达的干扰分子或敲除靶基因。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抑制靶基因表达的干扰分子针对：sucC中SEQ ID NO:37所示的序列或其互补序列、tdcD中SEQ ID NO:2所示的序列或其互补序列、scpB中SEQ ID NO:3所示的序列或其互补序列、scpA中SEQ ID NO:4所示的序列或其互补序列、ybiW中SEQ ID NO:5所示的序列或其互补序列、pflB中SEQ ID NO:6所示的序列或其互补序列、tdcE中SEQ ID NO:7所示的序列或其互补序列、pflD中SEQ ID NO:8所示的序列或其互补序列、paaF中SEQ ID NO:9所示的序列或其互补序列、fadJ中SEQ ID NO:10所示的序列或其互补序列、fadB中SEQ ID NO:11所示的序列或其互补序列、ackA中SEQ ID NO:12所示的序列或其互补序列、pta中SEQ ID NO:13所示的序列或其互补序列、leuD中SEQ ID NO:14所示的序列或其互补序列、leuC中SEQ ID NO:15所示的序列或其互补序列、yjiM中SEQ ID NO:16所示的序列或其互补序列、purT中SEQ ID NO:17所示的序列或其互补序列、dhaK1中SEQ ID NO:18所示的序列或其互补序列、dhaK2中SEQ ID NO:19所示的序列或其互补序列、dhaH中SEQ ID NO:20所示的序列或其互补序列、ptsH中SEQ ID NO:21所示的序列或其互补序列、ptsI中SEQ ID NO:22所示的序列或其互补序列、fsaA中SEQ ID NO:23所示的序列或其互补序列、ppk中SEQ ID NO:24所示的序列或其互补序列、aceF中SEQ ID NO:25所示的序列或其互补序列、cyoA中SEQ ID NO:26所示的序列或其互补序列、frdD中SEQ ID NO:30所示的序列或其互补序列、frdA中SEQ ID NO:31所示的序列或其互补序列、pgi中SEQ ID NO:32所示的序列或其互补序列、sdhA中SEQ ID NO:33所示的序列或其互补序列、sdhB中SEQ ID NO:34所示的序列或其互补序列、sdhC中SEQ ID NO:35所示的序列或其互补序列、sdhD中SEQ ID NO:36所示的序列或其互补序列、sucD中SEQ ID NO:38所示的序列或其互补序列、tnaA中SEQ ID NO:39所示的序列或其互补序列、glcF中SEQ ID NO:40所示的序列或其互补序列、glcE中SEQ ID NO:41所示的序列或其互补序列、yaeR中SEQ ID NO:42所示的序列或其互补序列、lsrC中SEQ ID NO:43所示的序列或其互补序列、hemN中SEQ ID NO:44所示的序列或其互补序列、agaW中SEQ ID NO:45所示的序列或其互补序列、gdhA中SEQ ID NO:46所示的序列或其互补序列、cyoB中SEQ ID NO:47所示的序列或其互补序列、rpiA中SEQ ID NO:48所示的序列或其互补序列、rpiB中SEQ ID NO:49所示的序列或其互补序列、lpdA中SEQ ID NO:50所示的序列或其互补序列、serC中SEQ ID NO:51所示的序列或其互补序列、serB中SEQ ID NO:28所示的序列或其互补序列、serA中SEQ ID NO:29所示的序列或其互补序列、zwf中SEQ ID NO:174所示的序列或其互补序列、pgl中SEQ ID NO:175所示的序列或其互补序列、gnd中SEQ ID NO:176所示的序列或其互补序列、rpe中SEQ ID NO:177所示的序列或其互补序列、talA中SEQ ID NO:178所示的序列或其互补序列、talB中SEQ ID NO:179所示的序列或其互补序列、tktA中SEQ ID NO:180所示的序列或其互补序列、tktB中SEQ ID NO:181所示的序列或其互补序列、ulaE中SEQ ID NO:182所示的序列或其互补序列、yieK中SEQ ID NO:183所示的序列或其互补序列、purH中SEQ ID NO:184所示的序列或其互补序列、pyrB中SEQ ID NO:185所示的序列或其互补序列、pyrI中SEQ ID NO:186所示的序列或其互补序列、cysQ中SEQ ID NO:187所示的序列或其互补序列、pyrC中SEQ ID NO:188所示的序列或其互补序列、gmk中SEQ ID NO:189所示的序列或其互补序列、guaA中SEQ ID NO:190所示的序列或其互补序列、guaB中SEQ ID NO:191所示的序列或其互补序列、ndk中SEQ ID NO:192所示的序列或其互补序列、pyrF中SEQ ID NO:193所示的序列或其互补序列、pyre中SEQ ID NO:194所示的序列或其互补序列、pyrH中SEQ ID NO:195所示的序列或其互补序列、或hpt中SEQ ID NO:196所示的序列或其互补序列。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的靶基因选自：(a)核苷酸合成和其它代谢模块基因lsrC、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途径模块基因rpiA、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循环和氧化磷酸化模块基因frdD、frdA、sdhA、sucC或sucD；(d)糖代谢模块基因ptsH、ptsI或glcE；(e)6dEB前体代谢模块基因yjiM、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代谢模块基因fadB或dhaK2；(g)氨基酸和蛋白质合成代谢模块基因serC；或(h)frdD+sucC组合、lsrC+frdD组合、lsrC+sucC组合、talA+guaB组合或zwf+guaB组合。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抑制靶基因表达的干扰分子是sRNA。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的sRNA包括以下结构：启动子、靶基因抑制分子、终止子；较佳地，所述靶基因抑制分子与终止子之间，还包括：micF序列。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的sRNA被包含在表达载体中。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的宿主菌是能合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的原核细菌。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的能合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的原核细菌是能合成聚酮类化合物6-脱氧红霉内酯的大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，熊智强，宋书杰，刘巧霞，汪建峰，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31