生物转化合成普拉特霉素A1的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种生物转化合成普拉特霉素A1的方法，本发明专利技术技术方案如下：在ST-1作用下，以麦迪霉素为底物，通过生物转化的方法合成普拉特霉素A1，以及从转化后的发酵液中提取、分离、纯化，得到高纯度普拉特霉素A1。用此方法生产普拉特霉素A1的技术先进，工艺简单，适用于工业化生产。另外后提取技术摒弃了传统意义上的有机溶媒萃取法，减少环境污染，简化提纯步骤，降低生产成本，更适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
生物转化合成普拉特霉素A1的纯化方法
本专利技术公开了一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌突变株，生物转化合成普拉特霉素A1的方法。
技术介绍
大环内酯类抗生素能有效抗革兰氏阳性细菌、支原体、衣原体等，并且由于其可以口服施用以及毒性较低被划分为临床上重要的抗菌剂。麦迪霉素属于16-元环大环内酯类抗生素，是由生米卡链霉菌streptomycesmycarofaciens(ATCC21454)以及放线菌的类似种产生的。麦迪霉素通过作用于细菌核糖体的50S亚基，阻碍细菌蛋白质的合成而发挥作用。抗菌性能与红霉素相似，对革兰阳性菌和支原体显示很强的抗菌作用。普拉特霉素A1(platenomycinA1)最早是ＡkioKinumaki等从普特拉链霉菌streptomycesplatensissubsp.MalvinusMCRL0388中分离出来，当初被命名为YL704A1，经过了发酵液的浓缩、分离，制备出了相应的盐，并进行了结构确证和抑菌试验，发现该抗生素是一种新的、能够有效抑制革兰氏阳性菌的大环内酯类抗生素(AkioKinumaki，IsaoTakamori.JAntibiot(Tokyo)1974Feb；27(2):102-6.)，而且其毒性很低。普拉特霉素A1与麦迪霉素主体结构基本相同，不同之处在于麦迪霉素各组分的碳霉糖环4’’位上为丙酰基或丁酰基，而普拉特霉素A1的4’’位上为异戊酰基。后来我国姜威等人在研究螺旋霉素酰基化过程中，也发现了中间体普拉特霉素A1(又命名为生技霉素A0)，文中报道了这一化合物的分离，性质及结构(姜威孙承航金文藻中国抗生素杂志2002年第07期)，但至今为止对于普拉特霉素A1的生产方法没有后续研究。耐热链霉菌Streptomycesthermophilus是一种具有重要工业价值的链霉菌，它能够生物转化泰乐菌素生产乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)。已有的研究表明分别负责乙酰基化和异戊酰基化功能的基因为acyA基因和acyB1基因，以及acyB1的正调节基因acyB2。本实验室对原有的耐热链霉菌进行了紫外诱变，筛选出了能够转化麦迪霉素为普拉特霉素A1的诱变菌株，并命名为ST-1。该菌株已经于2010年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.4040，拉丁名为Streptomycesthermotolerans。本专利技术建立一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌的突变株ST-1，生物转化合成普拉特霉素A1的新生产方法；并且提供了一种新的从转化后的发酵液中提取、纯化普拉特霉素A1的方法，该方法摒弃了传统的溶媒萃取法，在减少环境污染，简化萃取步骤的同时，获得了较纯的普拉特霉素A1固体。
技术实现思路
本研究的主要目的是提供一种生物转化合成普拉特霉素A1的方法，即以麦迪霉素为底物，利用ST-1，生物转化合成普拉特霉素A1。本研究的另一目的是提供最适的转化合成普拉特霉素A1的发酵条件，其具体条件如下：1培养基条件该菌的种子培养基组分为：大豆粉，玉米淀粉，酵母提取物，K2HPO4，MgSO4·7H2O。发酵转化过程中使用培养基组分为:玉米淀粉，大豆粉，酵母提取物，MgSO4·7H2O，K2HPO4，KH2PO4。发酵过程中，因为泡沫的产生，需要在培养基中加入消泡剂，如硅油、植物油或表面活性剂。2培养条件：温度、pH及培养时间种子培养过程中的温度和pH：ST-1是好氧菌，在pH6.0-8.0范围内，培养温度为25℃-35℃条件下，生长良好。种子培养时间为24-48小时，其中最优生长条件为pH7.0，温度为34℃，培养时间为30小时。发酵转化过程中的温度和pH：发酵培养基在pH6.0-8.0范围内，温度为25℃-35℃条件下能够进行生物转化，最优发酵条件为pH7.0，温度为30℃。3发酵过程分为摇瓶和发酵罐两种水平，培养基的碳源、氮源和无机盐组成成分和含量是具有较大差异的，发酵罐培养基的碳源需要在发酵过程中流加葡萄糖。种子培养液接种到发酵培养基中的接种量为2％-10％，摇瓶的最优接种量为6％，发酵罐的最优接种量为3％。摇瓶转化时，当种子在发酵培养基中生长约30-40小时后，一次性补入底物，底物麦迪霉素的配制，是利用磷酸调pH至酸性，使麦迪霉素完全溶解转变成盐溶液后，补入培养液中，继续转化48-60小时；发酵罐转化时，当种子在发酵罐中培养30-40小时后，通过蠕动泵流加补麦迪霉素底物盐溶液，补48hr，停止补料后，继续培养12-20小时，当普拉特霉素A1的转化量达到最高值下罐。4液相检测普拉特霉素A1：生物转化过程中，取10-30ml发酵液，加入同等体积的50％甲醇，超声波处理30min-1hr，再经过0.45um滤膜过滤发酵液，处理过的样品进行高效液相检测，检测麦迪霉素转化成普拉特霉素A1的转化率。本专利技术的另一目的是提供一种普拉特霉素A1的提取、纯化工艺，采用了酸提取、碱沉淀的技术方案。具体步骤如下：1一次酸溶：发酵液中的麦迪霉素被大部分转化成普拉特霉素A1，用无机酸或有机酸溶液调节发酵液成酸性，pH达2-6，优选pH3-4使发酵液中的普拉特霉素A1溶解出来，搅拌，离心或膜过滤，得到“普拉特霉素A1一次酸溶液”。2碱沉淀除杂质：上述“普拉特霉素A1一次酸溶液”加入碱性溶液调pH7.0-8.0，优选pH为7.0-7.5，发酵液离心或过滤，去除一部分沉淀杂质，保留发酵液滤液。3上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调pH9.0-11.0，优选9.0-10.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1一次碱沉淀”。4“普拉特霉素A1一次碱沉淀”中加入酸性溶液调pH2-6，优选pH3-4，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素A1盐溶液”。5“普拉特霉素A1盐溶液”中加入碱性溶液调pH9.0-11，优选9.0-10.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1二次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素A1碱固体物”成品。6“普拉特霉素A1碱固体物”继续用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱检测，收到纯度较高的“普拉特霉素A1甲醇溶液”，蒸干浓缩得到高纯度的普拉特霉素A1固体。本专利技术普拉特霉素A1的提纯方法，所述的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种；所述的酸性溶液包括硫酸、盐酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸中的一种。附图说明以下，结合附图来详细说明本专利技术原理和实施方案，其中：图1ST-1摇瓶水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相图图2普拉特霉素A1的结构图图3ST-1发酵罐水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相图图4提取纯化后的高纯度普拉特霉素A1高效液相图具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术中，除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。以下参照具体的实施例来说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种普拉特霉素A1的提取、分离、纯化方法，包括如下步骤：(1)一次酸溶：用无机酸或有机酸酸性溶液调节发酵液成酸性，pH达2‑6，搅拌，离心或膜过滤，得到普拉特霉素A1的一次酸溶液；(2)碱沉淀除杂质：上述“普拉特霉素A1一次酸溶液”加入碱性溶液调pH7.0‑8.0，发酵液离心或过滤，保留发酵液滤液；(3)上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调pH9.0‑11.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1一次碱沉淀”；(4)“普拉特霉素A1一次碱沉淀”中加入所述酸性溶液调pH2.0‑6.0，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素A1盐溶液”；(5)“普拉特霉素A1盐溶液”中加入所述碱性溶液调pH9.0‑11，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1二次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素A1碱固体物”成品；(6)“普拉特霉素A1碱固体物”用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱检测，收到纯度较高的“普拉特霉素A1碱甲醇溶液”，蒸干浓缩得到高纯度的普拉特霉素A1固体。

【技术特征摘要】
1.一种普拉特霉素A1的提取、分离、纯化方法，包括如下步骤：(1)一次酸溶：用无机酸或有机酸酸性溶液调节发酵液成酸性，pH达2-6，搅拌，离心或膜过滤，得到普拉特霉素A1的一次酸溶液；(2)碱沉淀除杂质：上述“普拉特霉素A1一次酸溶液”加入碱性溶液调pH7.0-8.0，发酵液离心或过滤，保留发酵液滤液；(3)上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调pH9.0-11.0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1一次碱沉淀”；(4)“普拉特霉素A1一次碱沉淀”中加入所述酸性溶液调pH2.0-6.0，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素A1盐溶液”；(5)“普拉特霉素A1盐溶液”中加入所述碱性溶液调pH9.0-11，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素A1二次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素A1碱固体物”成品；(6)“普拉特霉素A1碱固体物”用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴家鑫，蔡健，郑应华，齐鹏，葛辛玫，张国栋，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11