一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒，该试剂盒包括引物对，上述遗传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868 T>C、c.1484G>A、c.1888 C>T、c.569 C>T、c.616 A>G和c.1149 C>T中的一个或多个；上述引物对的上游引物和下游引物分别位于上述突变位点的上游和下游。通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了AR基因的6个新的突变位点，研究表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过使用本发明专利技术的试剂盒检测上述突变来实现对特发性无精子症的诊断检测。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及男性不育症检测领域，尤其涉及一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒。
技术介绍
全球约有10％～15％的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因，约影响1％的成年男性。男性不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷和环境因素等，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以推断遗传因素起了很大作用。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，人们已发现近200个基因与男性不育症的发生密切相关；采用基因敲除技术，发现近400个基因与小鼠精子发生密切相关，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原因。对这些突变基因的研究将有助于男性不育症的诊断，也有助于将来在体外受精过程中防止将遗传缺陷带给下一代。雄激素受体(AR，NCBI Gene ID:367)是一种重要的类固醇激素受体，在男性性分化和维持正常精子发生过程中发挥关键作用。AR属于核转录因子调控的类固醇激素作用的家族。AR有4个蛋白结构，包括N末端反式激活结构域(NTD)，DNA结合域(DBD)，铰链区(HR)和羧基配体结合域(LBD)。它能结合雄激素，包括睾酮(T)和5α-二氢睾酮(DHT)的配体结合域，从而介导核易位和AR的转录调节功能。在过去的几年中，确定了一些AR突变或多态性，可以导致或与遗传疾病相关，如完全或部分雄激素不敏感综合征(CAIS和PAIS)。然而，还需要深入地研究以揭示AR突变与特发性无精子症(IA)的关系，为特发性无精子症的诊断提供依据和指导。
技术实现思路
为了确定IA患者AR基因突变的情况，我们将776例IA患者和709例正常生育男性的AR基因外显子测序，首次新发现5个错义突变和1个同义突变与IA的发生相关。基于本专利技术的发现，本专利技术提供一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A、c.1888C>T、c.569C>T、c.616A>G和c.1149C>T中的一个或多个。前5个突变位点是错义突变，第6个突变位点是同义突变。上述突变分别是在如SEQ ID NO:1所示的AR基因序列的编码区的第868位、1484位、1888位、569位、616位、1279位和1149位。前5个突变位点依次分别对应的氨基酸变化情况是p.C290R、p.S495N、p.R630W、p.T190I和p.S206G，即第290位氨基酸由C变为R、第495位氨基酸由S变为N、第630位氨基酸由R变为W、第190位氨基酸由T变为I、第206位氨基酸由S变为G。第6个突变位点没有对应的氨基酸变化。作为本专利技术的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T中的一个或多个。作为本专利技术的优选方案，上述序列的突变位点选自c.1888C>T。本专利技术还提供一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒，其中，该试剂盒包括引物对，上述遗传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A、c.1888C>T、c.569C>T、c.616A>G和c.1149C>T中的一个或多个；上述引物对的上游引物和下游引物分别位于上述突变位点的上游和下游。作为本专利技术的优选方案，上述引物对选自primer 1、primer 2或primer 3引物对，其中，上述primer 1引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示；上述primer 2引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示；上述primer 3引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:7所示。作为本专利技术的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T中的一个或多个。作为本专利技术的优选方案，上述序列的突变位点选自c.1888C>T。作为本专利技术的优选方案，上述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了AR基因的6个新的突变位点，构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明显差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变来实现对男性不育症(尤其是特发性无精子症)的诊断检测。本专利技术在突变位点的上游和下游分别设计上游引物和下游引物用于检测上述突变位点，实现特发性无精子症的诊断检测。附图说明图1为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点测序图谱；图2为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点影响的进化保守性的氨基酸；图3为在AR基因上发现的3个IA病人特异的错义突变的位置；图4为3个AR突变体对下游靶基因MMTV表达的影响，NC表示阴性对照，WT表示野生型。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。1实验内容1.1标本的收集本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人，其中特发性无精子症病人为776例，我们的筛选标准为：1)随机检查三次精液中无精子；2)生殖系统或盆腔无阻塞、炎症和损伤；3)无核型异常和Y染色体微缺失，另将709例正常可育男性(至少育有一个孩子且未行IVF、ICSI、IMSI等人类辅助生殖技术)作为对照进行研究。每例受试者均认真签署知情同意书，本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。1.2外显子测序抽取外周血提取基因组DNA，用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血，迅速置于-80℃冰箱中备用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血DNA。取出5微克基因组DNA送华大基因研究中心(深圳)进行外显子捕获、测序，在特发性无精子症患者中筛选出AR基因中的9个突变位点中，其中7个错义突变和2个同义突变，与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对，有5种错义突变和1个同义突变是我们首次发现的新突变。1.3验证错义突变以提取的外周血基因组DNA为模板，使用设计合成的3对引物对仅在特发性无精子症患者(W320，W691，W530)AR基因存在的3个错义突变位点(c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T)进行特异性扩增，AR序列从NCBI数据库中查得(NCBI Gene ID:367)。引物由Invitrogen公司合成，所合成的3对引物对见表1。表1 AR突变位点验证引物PCR扩增条件为：98℃预变性2min，然后以98℃10s、60℃30s、72℃45s进行35个循环，最后72℃延伸5min。DNA电泳：取3μl的PCR产物在1％琼脂糖凝胶孔中，14本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对，所述遗传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868 T>C、c.1484G>A、c.1888 C>T、c.569 C>T、c.616 A>G和c.1149 C>T中的一个或多个；所述引物对的上游引物和下游引物分别位于所述突变位点的上游和下游。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对，所述遗传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868 T>C、c.1484G>A、c.1888 C>T、c.569 C>T、c.616 A>G和c.1149 C>T中的一个或多个；所述引物对的上游引物和下游引物分别位于所述突变位点的上游和下游。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对选自primer 1、primer 2或primer 3引物对，其中，所述primer 1引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，其下游引物的序列如SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟丽莎，蔡志明，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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