检测副鸡禽杆菌的通用PCR引物、方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测副鸡禽杆菌的通用PCR引物、方法及其检测试剂盒。该PCR引物包括上游引物5’‑GCGTCAGTAGCACAAGCT‑3’和下游引物5’‑TTTAACTGAGATTTCTACACG‑3’，该检测试剂盒包含了上述PCR引物。本发明专利技术的整体思路为：样本总DNA的提取、使用通用引物扩增目标片段、凝胶电泳分析、结果判定。试验证明本申请适用于副鸡禽杆菌快速检测，具有操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种采用多聚合酶链式反应(PCR)技术对副鸡禽杆菌进行快速检测的通用PCR引物、通用PCR方法及检测试剂盒。
技术介绍
鸡传染性鼻炎(Infectous Coryza，IC)是由副鸡禽杆菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。本病发生后可引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，肉鸡肉质下降，造成很大的经济损失。Hpg为一细小、形态较规则的革兰氏阴性杆菌，大小约3×0.4-0.8um，无鞭毛，不形成芽孢。毒力菌株往往具有荚膜，但这种能力在体外传代时容易丧失。在临床病料及固体培养基上的细菌菌体形态较规则，呈明显的小杆状，而在液体培养基或老龄培养物中，会发生形态上的变异。传统的分型方法是Page的平板凝集法，将副鸡禽杆菌分为A、B、C三种血清型，但尚有一些分离株无法定型。近年来，不断有非A、B、C三种血清型的副鸡禽杆菌被分离出来。血凝素(haemagglutinin，HA)是副鸡禽杆菌抗原中重要的成分，也是很多菌株的保护性抗原成分。传统的副鸡禽杆菌抗体检测方法包括平板凝集试验(SPA)、琼脂扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)等，抗原检测方法则主要是细菌分离培养。SPA与AGP方法简便易行，但SPA抗原存在自凝和不凝的问题。HI方法常用于IC免疫后检测抗体滴度的上升情况，以此来评价疫苗免疫效果及鸡群安全状况，也用于感染的跟踪调查，但目前主要使用的特异性抗原只有A和C两个血清型。确诊通常需要进行细菌分离，有时还要进行更为复杂的动物回归实验。传统的病原分离方法虽然有效，在临床诊断中发挥着重要作用，但也存在确诊耗时较长的明显局限性。生物技术的飞速发展极大地推动了生命科学各个领域的发展，疾病的诊断、病原的检测已从细胞水平进入分子水平。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。多聚合酶链式反应(PCR)能够选择性地将基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。1996年，陈小玲用地辛高标记特异性DNA片段，并在此基础上通过设计的两对PCR引物建立了两种PCR方法。1998年，宋程发现用PCR诊断IC，在感染后1-2周内取样较其它方法更敏感、准确，并在PCR分型方面进行了探讨，证实了ERIC-PCR无法进行病原菌的分型。此外，国外亦有DNA限制性内切酶分析(REA)等多种试验方法的报道。大量研究结果证明，利用特异性引物对IC进行PCR扩增不失为一种快速、准确的检测方法。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测副鸡禽杆菌的通用PCR引物，以及使用了该引物的PCR扩增反应体系、PCR检测方法和检测试剂盒，该PCR扩增反应体系、PCR检测方法和检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一对检测副鸡禽杆菌的PCR引物，包括上游引物5’-GCGTCAGTAGCACAAGCT-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-TTTAACTGAGATTTCTACACG-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)。本专利技术还提供了一种包含上游引物5’-GCGTCAGTAGCACAAGCT-3’和下游引物5’-TTTAACTGAGATTTCTACACG-3’的检测试剂盒。本专利技术还提供了一种检测副鸡禽杆菌的PCR扩增的反应体系，包括以下组分：其中：上游引物为5’-GCGTCAGTAGCACAAGCT-3’，下游引物为5’-TTTAACTGAGATTTCTACACG-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的浓度，而非其在PCR扩增的反应体系中的终浓度。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，52℃45s，72℃60s；循环结束后72℃延伸10min。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述样本取自待测菌悬液或禽类临床病料，如：鸭、鹅或鸡的临床病料，优选鸡的临床病料。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，当样本取自禽类临床病料时，样本总DNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取泄殖腔拭子样本、口咽拭子样本或脏器组织样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心取上清。本专利技术还提供了一种检测副鸡禽杆菌的PCR方法，包括如下步骤：1)样本总DNA的提取；2)利用上游引物5’-GCGTCAGTAGCACAAGCT-3’和下游引物5’-TTTAACTGAGATTTCTACACG-3’，对步骤1)所得的DNA进行PCR扩增；3)分析步骤2)所得PCR产物，如果扩增产物包含969bp的片段，则样本为副鸡禽杆菌检测阳性，否则为检测阴性。即：需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，目的条带即为969bp的片段。本专利技术参照GenBank登录的检测不同基因型副鸡禽杆菌DNA polymerase基因的保守区序列设计和筛选特异性检测引物，以NCBI数据库中标准菌株Hpg-Modesto(GenBank登录号为AF491827)的hagA基因序列作为参考，通过新型引物，扩增Hpg hagA基因中的保守区序列长度约969bp的核苷酸序列，上游引物对应于Hpg hagA基因的46bp-63bp之间，下游引物对应于HpghagA基因的994bp-1014bp之间。整体思路为：提取样本DNA后，利用本申请引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：预变性94℃5min，30个循环(94℃45s，52.2℃45s，72℃60s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为Hpg检测阳性，否则为检测阴性。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)扩增的目的片段位于Hpg的hagA基因的相对保守区，且核苷酸序列为969bp，因而敏感性好、操作方便、对不同基因型的Hpg均有较好检出，即通用性好；2)使用本申请中引物的PCR扩增反应体系、PCR检测方法和检测试剂盒对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒和禽传染性喉气管炎病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明使用本申请中引物的PCR扩增反应体系、PCR检测方法和检测试剂盒也具有良好的特异性；3)使用本申请中引物的PCR扩增反应体系、PCR检测方法和检测试剂盒适用于养禽生产中进行Hpg的检测，具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，克服了细菌分离等传统检测方法的耗时较长，以及对分离株血清型鉴定没有广泛应用，不利于快速诊断和确定分离株血清型的缺点。本方法可扩增血清A、B、C型和非血清A、B、C型的Hpg，同时此引物可用于Hpg的序列测定中，通过测序了解其基因型，从血凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对检测副鸡禽杆菌的PCR引物，其特征在于，包括：上游引物5’‑GCGTCAGTAGCACAAGCT‑3’；以及下游引物5’‑TTTAACTGAGATTTCTACACG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一对检测副鸡禽杆菌的PCR引物，其特征在于，包括：上游引物5’-GCGTCAGTAGCACAAGCT-3’；以及下游引物5’-TTTAACTGAGATTTCTACACG-3’。2.一种包含权利要求1所述PCR引物的检测试剂盒。3.一种PCR扩增的反应体系，其特征在于，包括以下组分：4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，52.2℃45s，72℃60s；循环结束后72℃延伸10min。5.根据权利要求3所述反应体系，其特征在于，所述样本取自待测菌悬液或禽类临床病料，优选鸡、鸭或鹅的临床病料。6.根据权利要求3所述反应体系，其特征在于，当样本取自禽类临床病料时，样本总DNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取泄殖腔拭子样本、口咽拭子样本或脏器组织样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国中，冯金玲，徐美玉，任颖超，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11