壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法，制备方法为：(1)将丝素蛋白、模板微粒和碳酸盐缓冲液混合得混合液一，滴加蛋白的不良溶剂，混合，离心，除上清液，水洗，得第一种微粒；(2)将第一种微粒、丝素蛋白和碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，离心，除上清液，水洗，得第二种微粒；(3)重复步骤(2)；(4)向步骤(3)获得的微粒中加戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。本发明专利技术的微囊是一种中空微囊，可负载生物大分子类药物或其他功效组份。易于操作，省时节能，适合于规模化生产，所用材料具有良好的生物相容性、生物可降解性且无免疫原性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药及美容护肤领域，具体地涉及一种壳层可控的丝素蛋白微囊及制备方法
技术介绍
中空结构的载体在药物传递、生物反应器、生物传感器等领域具有广泛的应用。其中，微囊类载体受到了越来越多的关注。利用层层自组装(Layer-by-layer,LbL)技术，将带正负电荷的聚电解质交替沉积于模板表面再将模板去除，从而得到聚电解质微囊，是制备该类载体最常用的方法。这种方法简便易行、适用范围广，可精确控制微囊的大小、形状、组分等，并可通过改变沉积层数，控制微囊的厚度，进而调节微囊的通透性及其他功能特性。然而，LbL法合成微囊基载体存在固有缺陷，如荷正电的聚电解质的引入存在潜在生物毒性。为克服以上不足，研究者利用多种相互作用机制制备单组分微囊，如2008年，H.J.组用戊二醛处理吸附于模板表面的牛血清白蛋白，交联的同时在最外层覆盖活性醛基，与下层BSA共价结合，从而用戊二醛介导的LbL法制备了牛血清白蛋白单组份微囊(Tong W.；Gao C.；H.,Colloid Polym.Sci.2008,286,1103-1109.)；2011年，Tsukruk组利用丝素蛋白可通过氢键及β折叠物理交联的特性，不引入荷正电聚电解质，用LbL法制备了丝素蛋白单组份微囊，避免潜在的生物毒性，同时保存了LbL法通过改变壳层层数调控通透性的能力(Shchepelina,O.；Drachuk,I.；Gupta,M.K.；Lin,J.；Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.)；2014年Germershaus组用LbL法制备负载质粒的丝素蛋白微囊，实现基因的有效低毒转染(Li L.；Puhl S.；Meinel L.；Germershaus O.,Biomaterials,2014,35,7929-7939.)。然而，LbL法仍存在操作繁琐、耗时耗能，并且产量随沉积层数增加大大降低的不足，亟待开发LbL衍生法或其他方法，从而提高其实际工业应用价值(Tong W,；Song X,；Gao C.；Chem.Soc.Rev.,2012,41,6103.Zhu,Y.；Tong,W.；Gao,C.；H.J.Mater.Chem.2008,18,1153-1158)。因此，一步法合成微囊受到越来越多的关注，该方法操作简便快捷且省时省力，并可通过调节分子量以及去溶剂的量调节微囊的厚度，进而调节其通透性(Zhu Y.；Tong W,Gao C.；H.J.,Mater.Chem.2008,18,1153-1158.Wang Y.；Bansal V.；Zelikin AN.；Caruso F.,Nano Lett.2008,8,1741-1745.)；本课题组用去溶剂法制备丝素蛋白单组份微囊，一步去溶剂产生微囊厚度约为22.42±8.45nm，相当于LbL法制备的8-10层丝素蛋白沉积得到微囊的厚度，尽管这种单组份微囊孔洞较大，但本课题组修饰纳米金调节其通透性(ZL201410066374.3；Du,B.；Wang,J.；Zhou,Z.；Tang,H.；Li,X.；Liu,Y.；Zhang,Q.Chem.Commun.,2014,50,4423-4426.)。然而，将材料无毒可降解、方法温和简便、微囊通透性精确可控集于一体的单组份微囊及其制备方法还未见报道。丝素蛋白具有卓越的机械稳定性、良好的生物相容性、生物可降解性，是生物活性组份
载体的理想材料。因此，以有机、无机微粒为模板，利用去溶剂法结合LbL法(层层去溶剂法)高效合成通透性可控的丝素蛋白单组份微囊作为功效组份载体在医药及美容护肤领域研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简捷、省时节能、通透性可调节的壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供一种壳层可控的丝素蛋白微囊。本专利技术的第三个目的是提供一种壳层可控的丝素蛋白微囊的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，包括如下步骤：(1)将丝素蛋白、模板微粒和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.4-1.5mg/mL、模板微粒的浓度为6-15mg/mL；向混合液一中滴加蛋白的不良溶剂，混合均匀，所述混合液一与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒；(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒；(3)重复步骤(2)0、1、2、3、4或5次；(4)向步骤(3)获得的微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。蛋白的不良溶剂优选甲醇或乙醇。模板微粒优选碳酸钙微粒、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒或分子量为5000-50000的聚乳酸微粒。上述方法制备的壳层可控的丝素蛋白微囊。壳层可控的丝素蛋白微囊在制备载功效组份微囊中的应用。所述功效组份优选蛋白或多糖。本专利技术的壳层可控的丝素蛋白微囊是一种中空微囊，可负载生物大分子类药物或其他功效组份。制备工艺普适性强，易于操作，省时节能，适合于规模化生产，而且所用材料具有良好的生物相容性、生物可降解性且无免疫原性。本专利技术制备的七层丝素蛋白微囊通透性相当于文献LbL法制备的12层丝素蛋白微囊的通透性，五层丝素蛋白微囊的通透性介于LbL法制备的8-10层丝素蛋白微囊通透性之间，简化了制备流程。与本研究组此前授权的专利比较，单层去溶剂微囊孔径大于31.8nm，修饰金纳米粒子封堵单层微囊后孔径小于8nm。本专利技术中，层层去溶剂沉积调控更精确细致，如五层丝素蛋白微囊的孔径在22.9nm左右，七层丝素蛋白微囊的孔径小于8nm，与单层加金纳米粒子修饰封堵后的效果相当，但无需引入金纳米粒子，降低成本的基础上，减少了不可降
解材料的应用。本专利技术更适合在功效组份载体、靶向递送及护肤美容领域中应用。附图说明图1为实施例5制备的壳层可控的丝素蛋白微囊(三层)的透射电镜照片；丝素蛋白的浓度分别为(a)0.4mg/mL；(b)0.7mg/mL；(c)1mg/mL；(d)1.3mg/mL。图2为实施例6制备的壳层可控的丝素蛋白微囊的扫描电镜照片；(a)单层微囊(对比)；(b)三层微囊；(c)五层微囊；(d)七层微囊。图3为实施例7采用碳酸钙微粒为模板制备的丝素蛋白微囊的扫描电镜照片；(a)碳酸钙模板；(b)三层微囊。图4为实施例6制备的三层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 2000KDa溶液中的共聚焦显微镜照片。图5为实施例6制备的五层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 500KDa(a)以及FITC-dextran 2000KDa(b)溶液中的共聚焦显微镜照片。图6为实施例6制备的七层丝素蛋白微囊在FITC-dextran 250KDa(a)以及FITC-BSA(b)溶液中的共聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将丝素蛋白、模板微粒和pH＝9‑11的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.4‑1.5mg/mL、模板微粒的浓度为6‑15mg/mL；向混合液一中滴加蛋白的不良溶剂，混合均匀，所述混合液一与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6‑10；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒；(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9‑11的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6‑10；离心，除去上清液，水洗，得到第二种微粒；(3)重复步骤(2)0、1、2、3、4或5次；(4)向步骤(3)获得的微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到最终微粒；洗最终微粒，去除模板微粒，再水洗得到壳层可控的丝素蛋白微囊悬液。

【技术特征摘要】
1.一种壳层可控的丝素蛋白微囊的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将丝素蛋白、模板微粒和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液一，使混合液一中丝素蛋白的浓度为0.4-1.5mg/mL、模板微粒的浓度为6-15mg/mL；向混合液一中滴加蛋白的不良溶剂，混合均匀，所述混合液一与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，离心，得到第一种微粒；(2)将第一种微粒、与步骤(1)等量的丝素蛋白，和pH＝9-11的碳酸盐缓冲液混合，得混合液二，使混合液二的体积与混合液一的体积相等，向混合液二中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液二与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，水洗，得到第...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志敏，王宏伟，杜博，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，承德医学院，
类型：发明
国别省市：天津;12