本发明专利技术目的是提供一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT‑PCR检测试剂盒及引物、探针。本发明专利技术的第一个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒；本发明专利技术的第二个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的检测引物和探针；本发明专利技术的第三个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT‑PCR检测方法。本发明专利技术实现在猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术目的是提供一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物、探针。
技术介绍
猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，病毒粒子呈圆形，其RNA为单股正链。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)为动脉炎病毒属，病毒粒子呈球型，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)H1亚型为正黏病毒科甲型流感病毒，病毒粒子多形性，有囊膜，基因组为分节段单股负链RNA。以上三种病原均为RNA病毒，均会造成养猪业巨大经济损失，引起的临床症状有类似之处，甚至有可能同时混合感染，但不同病原感染引起的危害性、流行性及其防控措施截然不同。因此，建立一种区分三种病原的检测方法非常重要，准确灵敏的检测方法能有效防止疾病的传播，减少经济损失。ELISA、RT-PCR等免疫学和分子生物学检测方法已经应用在上述疫病的诊断中，但目前主要用于单一病原的检测，其灵敏性、特异性和简便性等方面均有待进一步提高,普通RT-PCR检测结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。本专利技术采用三重荧光RT-PCR检测方法能够同时检测区分这三种病毒，不但可提高灵敏性、特异性和简便性等，还可节约大量时间和成本。上述3种病原都可以通过在保守区域设计特异性引物和探针，进行荧光RT-PCR检测。荧光实时定量PCR(Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。AllgloTM探针是美国AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代荧光定量探针，它打破传统Taqman探针的一端报告基团一端粹灭基团的限制，其最大优势是探针两端标记同样的荧光基团，探针在水解之前荧光基团互相淬灭，水解后均为报告发光基团，大大提高探针的荧光强度和灵敏性，AllgloTM探针染料上面含有特殊的能提高Tm值的化学基团(BGB)，可以大大提高探针特异性。多重荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因。在多重定量应用领域，AllgloTM探针避免了TaqMan探针相互抑制的问题，探针染料采用比较容易酶切的化学基团，多条AllgloTM探针在一个反应体系中相互干扰非常小，使一个荧光反应检测多种病原微生物的效果非常好。根据该原理设计特异性多重荧光探针，常用的荧光基团有MAR、JUP、URA等，可通过不同的荧光检测通道，同时检测多种荧光信号。由于该方法引入了特异 性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。
技术实现思路
为了实现同步检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型，本专利技术的第一个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒；本专利技术的第二个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的检测引物和探针；本专利技术的第三个目的是提供猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光定量RT-PCR检测方法。本专利技术实现在猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用的技术方案是：猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M-MLV、MgCl2、DNA聚合酶、特异性引物和荧光探针、阳性参考品、阴性参考品，所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：猪瘟-F：GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC猪瘟-R：GGCATGCCCTCGTCCAC猪瘟-P：MAR-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG-MAR；猪繁殖与呼吸综合征病毒-F：TTGTTTGGCTTCACAATCGC猪繁殖与呼吸综合征病毒-R：GTAGAGCGCGCACGGAGTA猪繁殖与呼吸综合征病毒-P：JUP-TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT-JUP；猪流感病毒H1型-F：GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA猪流感病毒H1型-R：CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC猪流感病毒H1型-P：URA–CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA-URA。对于脱氧三磷酸核苷混合物、MgCl2、DNA聚合酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。作为优选，猪瘟病毒阳性参考品的序列：AACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGGGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACC；猪繁殖与呼吸综合征病病毒阳性参考品的序列：CTCAGGGTGAACGGTAGAGCGCGCACGGAGTACCGCGGAGCAAACCAGTCTGATGCATAAGACCACCAGCCAACCGGCGATTGTGAAGCCAAACAAAATGGGC；猪流感病毒H1型阳性参考品的序列：ACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCAGTCACAATTGGAGAATGTCCAAAATATGTCAAAAGCACAAAATTGAGAATGGCTACAGGACTAAGGAATATCCCGTCTATTCAAT。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用的技术方案是：猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测用特异性引物和Allglo荧光探针序列，所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：猪瘟-F：GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC猪瘟-R：GGCATGCCCTCGTCCAC猪瘟-P：MAR-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG-MAR；猪繁殖与呼吸综合征病毒-F：TTGTTTGGCTTCACAATCGC猪繁殖与呼吸综合征病毒-R：GTAGAGCGCGCACGGAGTA猪繁殖与呼吸综合征病毒-P：JUP-TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT-JUP；猪流感病毒H1型-F：GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA猪流感病毒H1型-R：CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC猪流感病毒H1型-P：URA–CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA-URA。为了实现上述的第三个目的，本专利技术采用的技术方案是：猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测方法，所述方法如下：1)提取待测样品RNA，该步骤所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M‑MLV、MgCl2、DNA聚合酶、特异性引物和荧光探针、阳性参考品、阴性参考品，所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：猪瘟‑F：GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC猪瘟‑R：GGCATGCCCTCGTCCAC猪瘟‑P：MAR‑CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG‑MAR；猪繁殖与呼吸综合征病毒‑F：TTGTTTGGCTTCACAATCGC猪繁殖与呼吸综合征病毒‑R：GTAGAGCGCGCACGGAGTA猪繁殖与呼吸综合征病毒‑P：JUP‑TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT‑JUP；猪流感病毒H1型‑F：GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA猪流感病毒H1型‑R：CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC猪流感病毒H1型‑P：URA–CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA‑URA。
【技术特征摘要】
1.猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M-MLV、MgCl2、DNA聚合酶、特异性引物和荧光探针、阳性参考品、阴性参考品，所述的特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：猪瘟-F：GGACTAGCCRTAGTGGCGAGC猪瘟-R：GGCATGCCCTCGTCCAC猪瘟-P：MAR-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGG-MAR；猪繁殖与呼吸综合征病毒-F：TTGTTTGGCTTCACAATCGC猪繁殖与呼吸综合征病毒-R：GTAGAGCGCGCACGGAGTA猪繁殖与呼吸综合征病毒-P：JUP-TTGGCTGGTGGTCTTATGCATCAGACT-JUP；猪流感病毒H1型-F：GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA猪流感病毒H1型-R：CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC猪流感病毒H1型-P：URA–CAGAATATACATCCRGTCACAATTGGARAA-URA。2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于猪瘟病毒阳性参考品的序列：AACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGGGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACC；猪繁殖与呼吸综合征...
【专利技术属性】
技术研发人员：何永强，莫虹斐，帅江冰，曾若雪，门光琦，曹爱玲，金晨晨，张晓峰，李辉，王素华，余招锋，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。