本发明专利技术公开了一种可以同时检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对奶牛CVM、BLAD、DUMPS、CN四种遗传病基因相关的4处多态性位点进行检测。此外，本发明专利技术还公开了能够同时联合检测以上遗传病和奶牛A2基因型的检测方法及其检测产品，该联合检测的结果可用于指导健康奶牛的筛选、育种等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测领域，涉及一种用于检测奶牛脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病相关的基因突变的核酸质谱的制备方法及应用。具体而言，即利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对奶牛的SLC35A3基因4号外显子第559位、CD18基因第二外显子第55位、UMPS基因第5个外显子上的密码子405位、ASS基因第5外显子的第86个氨基酸进行检测，确定某奶牛在该四个位点处是否存在突变，涉及筛选无此四种遗传病的奶牛的筛选方法。
技术介绍
荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种，用于生产大量鲜乳供应我们日常食物的需求，经高度选育与良好的饲养管理，生产性能不断提高，在人类生活中发挥着越来越重要的作用。随着人工授精技术和胚胎移植技术的发展，有潜力的优良公牛被用于制作大量冷冻精液，供给众多母牛配种使用，其优良遗传性能迅速地传播至世界各地。然而，奶牛间的近交现象也不断增加，若追溯全世界荷斯坦奶牛的系谱，其亲缘大都密集地来自几个特定的公牛家族。此外，具有遗传缺陷的公牛携带者不会表现任何病症，一旦其冻精被大规模使用，其隐性有害基因则会在牛群中快速传播，给奶牛业造成巨大经济损失。在我国，进口检验检疫的重点在于防止动物传染病和寄生虫病的传入，对遗传病的危害尚缺乏足够的重视，因此，大量进口的种牛、胚胎、冷冻精液等大大增加了遗传缺陷在我国快速传播的风险。所以，急需建立全面、完善的检测、防控体系。牛遗传病主要由遗传物种变异(如基因突变、染色体畸变)引起的身体或生理缺陷，可由亲代传递给后代。人工授精技术在奶牛育种中的广泛应用，使得遗传病传播的危险性大大增加。然而，目前我国大部分地区畜牧部门和养殖户对于奶牛遗传病的管控管理并不清晰，人们对于遗传病的认识不够，因遗传病导致的奶牛健康问题不断出现，对奶牛业的经济效益造成恶行影响。此外，带病奶牛制品还会对人类的身体健康产生危害。因此，在奶牛遗传育种过程中有效地预防奶牛遗传病的扩散对奶牛业的健康发展至关重要。奶牛遗传病中由常染色体单基因控制的情况较多。其中，完全显性突变引起的遗传缺陷易发现、易淘汰，而隐性有害基因只有在纯合时发病，杂合时却不易发现。隐性遗传病的传播扩散与近交密切相关，使得隐性有害基因的纯合率大大增加。隐性遗传病的遗传机理在于，由于等位基因(Aa)的显隐性关系，杂合子并不会表现发病，但如果两个表型正常的携带者(Aa)进行交配，产生表型正常与缺陷纯合后代的比例为3:1，后代基因型AA、Aa、aa个体的比例为1:2:1，也就是50％的个体为携带者，如果在胚胎时期隐性纯合个体(aa)发生流产或出生时即死亡，那么其后代携带者的比例为2/3，也就是67％的个体为携带者。因此，在奶牛遗传育种过程中检测并淘汰表型正常的携带者对控制隐性遗传病的扩散尤为重要。脊椎畸形综合症(Complex Vertebral Malformation，CVM)是荷斯坦牛的一种由常染色体单基因控制的隐性遗传病，最早由丹麦科学家于1999年发现。最初，丹麦科学家发现荷斯坦牛群中存在体型较小、脊椎畸形、两前腿筋腱变短、无法直立行走、颈短、心脏畸形等各式各样病变的新生犊牛。另外，CVM对奶牛的繁殖性状也有很大影响，导致母牛的不返情率提高，产犊间隔大大延长，流产比例上升，并直接影响产奶量，导致母牛非计划性淘汰，最终造成严重的经济损失。Thomsen B等人报道了(Genome Res,2006,16(1):97–105)该遗传病的产生是由于奶牛第3号染色体(BTA3)上的SLC35A3基因外显子4的第559位的单碱基发生突变(G/T)所致；该基因编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白，该突变导致其第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸，从而影响其正常的生理功能。其中，研究者通过与CVM基因座的连锁分析，确定并公开了可用于鉴定CVM的疾病基因的连锁标记-12个小随体，即微卫星(SSR)标记。白细胞粘附缺陷症(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)也是发生在荷斯坦牛中的一种常见遗传性免疫缺陷病，为常染色体单基因隐性遗传病。该病是一种牛的造血系统的遗传性疾病，以严重的重复性感染、缺少脓液形成、损伤愈合延迟和白细胞增多症为特症，实质是白细胞粘附及相关的功能包括吞噬和趋化作用的缺陷。患病牛的常见症状表现为口腔粘膜、牙龈和舌粘膜溃疡，牙龈萎缩，病程长者前臼齿脱落；粘膜和肠道等软组织发生重复性感染，泛发性淋巴样增生；易感染肺炎、持续性嗜中性粒细胞数目增多、生长发育受阻、胃肠粘膜溃疡、慢性腹泻，最终导致早期死亡。其致病机理是一种与白细胞粘附有关的细胞表面糖蛋白——β2整合素(CD18)表达缺陷，CD18基因编码区的第383位的碱基由A突变为G(A383G)，导致第128位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代，致使白细胞表面的整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。牛的CD18基因已经被定位在1号染色体上。牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficiency of Uridine Monophos Phate Synthase，DUMPS)，也称单谱病，是荷斯坦牛群中一种常染色体单基因隐性遗传病。患该病的牛的主要症状为血液中瓜氨酸含量很高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致胚胎死亡，即使犊牛能顺利出生，但在出生一周内死亡，或母牛怀孕约40d左右即流产。DUMPS的遗传学基础是奶牛1号染色体(BTA1)上的UMPS基因C-末端405处的密码子存在着一个点突变(C405T)，原编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的TGA，从而导致突变基因的转录产物最终翻译成一段C－末端缺失76个氨基酸催化亚基的短蛋白，造成乳清酸转化为鸟苷酸的催化功能丧失，不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸，从而导致胚胎在妊娠40～60d时死亡，死亡率100％。瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)又称精氨酸合成酶缺失症(Bovine Argininosuccinate Synthetase Deficiency)，是一种引起荷斯坦牛尿循环代谢紊乱的常染色体单基因隐性遗传缺陷病。发病个体由于缺乏尿素代谢过程中催化瓜氨酸生成精氨酸琥珀酸的关键酶-精氨酸琥珀酸合成酶，而导致瓜氨酸不能转变为精氨酸琥珀酸，引起机体内尿代谢紊乱。这一代谢紊乱的发生使体内代谢生成的瓜氨酸前体-氨无法转变为尿素，而无法排出体外，从而在组织或血液中积累大量对机体有害的氨，最终导致犊牛在出生一周内死亡。该病最早于1986年在澳大利亚的荷斯坦牛群中发现。引发机体病变的遗传学基础是奶牛第11号染色体(BTA11)上的编码精氨酸合成酶的ASS基因的第5外显子第86个氨基酸发生单碱基突变(C→T)，第86位氨基酸突变为终止密码子，从而使ASS功能丧失。目前，常用的检测奶牛常染色体单基因单碱基多态性遗传病的分子诊断方法有：(1)PCR-SSCP聚合酶链式反应—单链构象多态性(polymerase chain reactions-single stranded conformation polymorphism)，是一种基于PCR的单链构象多态性分析技术。即相同长度的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于核酸质谱法检测奶牛的脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物组，包括以下序列：
【技术特征摘要】
2015.12.10 CN 20151090926431.一种用于核酸质谱法检测奶牛的脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物组，包括以下序列：2.权利要求1所述的引物组，其中，延伸引物及延伸产物的分子量如下：3.权利要求1-2的引物组，其中，PCR扩增引物序列为核心序列，其在5’端可包括5-15个保护碱基序列，优选为10bp的tag：5’-ACGTTGGATG-3’。4.权利要求1-3所述的引物组，其中，上述延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列。5.由权利要求1-4的引物组所制备的用于确定奶牛的脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的检测产品。6.权利要求5的检测产品，其中，产品为检测试剂盒，包括：(1)用于PCR的反应试剂，包括：权利要求1-4所述的特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；(2)用于PCR产物纯化的试剂；(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：权利要求1-4所述的延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。7.权利要求6的检测产品，其中，试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用的靶片，外切酶，动物基因组DNA提取试剂等试剂。8.权利要求6检测产品，其中，用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶Exo I，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶Exo I的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。9.利用权利要求1-4的引物组，或权利要求5-8的产品，来检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的方法，包括以下步骤：(1)多重PCR反应：使用特异性的针对包含所选择基因多态位点片段的PCR扩增引物，在一个反应体系内，通过多重PCR同时扩增含有不同多态位点的序列，得到含扩增目标区域的PCR产物；(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；(3)单碱基延伸：使用针对所选择SNP位点的特异延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆勇，张玉英，刘春城，王金金，马庆伟，柳春霞，王瑾瑾，林燕，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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