变体酶制造技术

本发明专利技术公开了糖基水解酶变体，尤其是糖基水解酶家族61中的某些氧化还原酶的变体。本发明专利技术还描述了编码所述糖基水解酶变体的核酸、包含所述糖基水解酶变体的组合物、制备所述变体的方法、以及使用所述变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关专利申请的交叉引用本申请要求所有在2013年7月29日提交的美国临时专利申请序列号61/859,630、61/859,666、61/859,680、61/859,704、61/859,712、61/859,721和61/859,735的优先权权益，所有这些专利内容全文以引用方式并入本文。专利
本公开总体上涉及糖基水解酶变体，尤其是糖基水解酶家族61的某些氧化还原酶的变体。本专利技术还描述了编码糖基水解酶变体的核酸、包含糖基水解酶变体的组合物、制备变体的方法以及使用变体的方法。政府权利本专利技术是在政府支持下遵照能源部颁发的有条件奖励项目No:De-Fc36-08go18078做出的。政府在本专利技术中享有一定权利。专利技术背景纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多产生胞外酶的微生物(包括细菌、酵母和真菌)降解并且用作能量源，所述胞外酶能够将聚合底物水解成单体糖(Aro等人，2001)。因为非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物方法对纤维素的有效利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，1997)。纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类别：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，1987；Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995)。β-葡糖苷酶用于从纤维二糖、纤维低聚糖和其它葡萄糖苷释放D-葡萄糖单元(Freer,1993)。已知很多细菌、酵母和真菌产生纤维素酶。某些真菌产生能够降解纤维素的结晶形式的全纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。丝状真菌发挥特别的作用，因为许多酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺乏水解纤维素的能力。(参见，例如，Aro等人，2001；Aubert等人，1988；Wood等人，1988和Coughlan等人。)CBH、EG和BG的真菌纤维素酶类别可进一步扩展以在每个类别内包括多个组分。例如，已经从包括里氏木霉(Trichoderma reesei)的多种真菌来源分离得到多种CBH、EG和BG，里氏木霉含有产生2种CBH(例如，CBH I(也称为Cel7A或糖基水解酶家族(GH)7A)和CBH II(也称为Cel6A或GH6A))的已知基因、多种EG(例如，EG I(也称为Cel7B或GH7B)、EG II(也称为Cel5A或GH5A)、EG III(也称为Cel12A或GH12A)、EGV(也称为Cel45A或GH45A)、EGVI(也称为Cel74A或GH74A)、EGVII(也称为Cel61B或GH61b)和EGVIII)的已知基因，以及一系列BG(例如BG1、BG3和BG5)的已知基因。为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，通常需要包含来自CBH、EG和BG每个类别的组分或酶活性的全纤维素酶体系，其中分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效(Filho等人，1996)。已观察到来自不同类别的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以更有效地降解纤维素。(参见，例如，Wood，1985)。纤维素酶用于处理纺织物以增强洗涤剂组合物的清洁能力、用作软化剂、用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)是本领域已知的。文献中已经描述了具有改善的清洁性能的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利4,435,307；英国申请2,095,275和2,094,826)和用于处理织物以改善纺织物的触感和外观的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利5,648,263、5,691,178、5,776,757和英国申请1,358,599；“The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report”，第24卷，第54-61页，1986)。纤维素酶用于将纤维素原料转化为乙醇也是本领域内已知的。这一转化方法具有许多优点，包括易于利用原本将被丢弃的大量原料(例如，燃烧或填埋该原料)。已经考虑将其它材料用作乙醇生产的原料，这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，例如，木材、草本作物和农业或城市废物。近年来，已经鉴定了为增强或加强纤维素材料的酶水解提供进一步辅助作用的新类别糖基水解酶，但是这些新型辅助酶中许多酶的作用机制尚未完全阐明。一个早期已被标注为GH61家族(参见例如，Harris等人，“Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61:Structure and Function of a Large,Enigmatic Family”Biochemistry 2010，第49卷，第3305–3316页)的此类糖基水解酶家族曾多次被重新标注，但在发现其中一些家族成员为溶解性多糖单加氧酶之后，其最近被标注为附属活力酶(AA)家族9(Levasseur A.等人，“Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes”Biotechnol Biofuels 2013，第6卷，第1期，第41页)。至少两种GH61酶存在于里氏木霉中(Saloheimo M.,“cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast”Eur J Biochem.1997，第249卷，第2期，第584-591页；Karlsson等人，“Homologous expression and characterization of Cel61A(EG IV)of Trichoderma reesei”Eur.J.Biochem.2001，第268卷，第6498-6507页；Karkehabadi等人，“The first structure of a glycoside hydrolase family 61member,Cel61B from Hypocrea jecorina,at 1.6A resolution”J Mol Biol.2008，第383卷，第1期，第144-154页；Martinez等人，“Genome sequencing and analysis of the b本文档来自技高网...

【技术保护点】
亲本糖苷水解酶家族61(GH61)酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性，并且相比于所述亲本GH61酶具有至少一种改善的性质，所述至少一种改善的性质选自：(a)表达，(b)热稳定性和/或Tm，(c)在全水解产物稀酸预处理玉米秸秆(whPCS)水解测定法中的性能，以及(d)在稀氨预处理玉米秸秆(daCS)水解测定法中的性能，其中所述变体包含在对应于SEQ ID NO:3的第111至114位以及第144至163位氨基酸的一个或多个位置处的至少一个氨基酸置换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.29 US 61/859,630;2013.07.29 US 61/859,666;1.亲本糖苷水解酶家族61(GH61)酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性，并且相比于所述亲本GH61酶具有至少一种改善的性质，所述至少一种改善的性质选自：(a)表达，(b)热稳定性和/或Tm，(c)在全水解产物稀酸预处理玉米秸秆(whPCS)水解测定法中的性能，以及(d)在稀氨预处理玉米秸秆(daCS)水解测定法中的性能，其中所述变体包含在对应于SEQ ID NO:3的第111至114位以及第144至163位氨基酸的一个或多个位置处的至少一个氨基酸置换。2.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体具有改善的热稳定性和/或Tm，并且其中所述至少一个氨基酸置换选自：I144G、D146F、L148P、A149P、G151Q、G151V、N152F、N152G、N152Q、N152S、N152Y、L155M、R156S、H157W、E158W、E158Y、I159Q、I160D、I160F、A161E、A161L、A161Y、L162A、L162F、H163L、H163R、H163Y、和它们的组合。3.根据权利要求1或2所述的变体，其中所述变体在whPCS水解测定法中具有改善的性能，并且其中所述至少一个氨基酸置换选自：I144K、I144R、I144S、P145G、P145H、P145I、P145K、P145R、P145S、P145V、D146A、D146C、D146E、D146F、D146K、D146M、D146Q、D146T、D146Y、N147F、N147M、L148K、L148V、A149C、A149D、A149F、A149G、A149I、A149N、A149V、P150A、P150C、P150D、P150E、P150F、P150G、P150H、P150I、P150K、P150L、P150Q、G151E、G151F、G151H、G151I、G151K、G151M、G151P、G151Q、G151S、G151V、G151W、G151Y、N152E、N152F、N152G、N152H、N152K、N152P、Y153F、Y153K、Y153L、Y153M、Y153P、Y153Q、Y153R、Y153S、Y153V、V154A、V154C、V154D、V154E、V154G、V154H、V154K、V154N、V154P、V154Q、V154R、V154T、L155C、L155F、L155K、L155M、L155N、R156A、R156C、R156D、R156E、R156F、R156H、R156I、R156K、R156L、R156M、R156P、R156Q、H157D、E158A、E158C、E158D、E158F、E158H、E158I、E158L、E158M、E158N、E158P、E158S、E158T、E158W、A161C、L162I、L162N、H163A、H163C、H163D、H163E、H163F、H163G、H163I、H163K、H163M、H163P、H163R、H163T、H163V、H163W、H163Y、和它们的组合。4.根据权利要求1、2或3所述的变体，其中所述变体在daCS水解测定法中具有改善的性能，并且其中所述至少一个氨基酸置换选自：F112V、K113L、K113M、K113N、K113R、K113S、I114F、I114V、I144F、I144V、P145A、Y153F、V154T、H163D、H163Y、和它们的组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体还包含选自以下的至少一个第二氨基酸置换：F112M、F112W、K113P、K113T、I114L、I114M、I114T、I144A、I144C、I144D、I144E、I144H、I144N、I144P、I144Q、I144T、I144W、I144Y、P145C、P145D、P145E、P145F、P145L、P145M、P145N、P145Q、P145T、P145W、P145Y、D146G、D146H、D146I、D146L、D146N、D146P、D146R、D146S、D146V、D146W、N147A、N147C、N147D、N147E、N147G、N147H、N147I、N147K、N147L、N147P、N147Q、N147R、N147S、N147T、N147V、N147W、N147Y、L148A、L148C、L148D、L148E、L148F、L148G、L148H、L148I、L148M、L148N、L148Q、L148R、L148S、L148T、L148W、L148Y、A149E、A149H、A149K、A149L、A149M、A149Q、A149R、A149S、A149T、A149W、A149Y、P150M、P150N、P150R、P150S、P150T、P150V、P150W、P150Y、G151A、G151C、G151D、G151L、G151N、G151R、G151T、N152A、N152C、N152D、N152I、N152L、N152M、N152R、N152T、N152V、N152W、Y153A、Y153C、Y153D、Y153E、Y153G、Y153H、Y153I、Y153N、Y153T、Y153W、V154F、V154I、V154L、V154M、V154S、V154W、V154Y、L155A、L155D、L155E、L155G、L155H、L155I、L155P、L155Q、L155R、L155S、L155T、L155V、L155W、L155Y、R156G、R156N、R156T、R156V、R156W、R156Y、H157A、H157C、...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·道格拉斯，M·福卡拉基，R·W·霍姆斯，T·卡佩尔，B·R·凯莱门，S·克拉利，S·E·兰茨，J·K·拉西拉，I·尼古拉耶夫，D·E·托雷斯帕兹米诺，W·范德尔克利，J·F·T·范利斯豪特，S·范斯提格桑斯，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US