本发明专利技术公开了一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，包括以下步骤：在靶标核酸存在下，连接酶介导寡核苷酸探针间3′端羟基和5′端磷酸基团反应形成磷酸二酯键，连接产物具有RNA聚合酶启动子序列，进而启动RNA聚合酶大量合成含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸继续介导寡核苷酸探针间的连接反应，RNA聚合酶的引入提高了连接反应效率，为后续的PCR反应提供了更多的扩增模板，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。该方法具有灵敏度高、特异性强、设计简单、反应时间短等特点，可广泛应用于生物基础研究和临床诊断中的核酸检测。
【技术实现步骤摘要】
一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法
本专利技术属于分析检测领域，尤其涉及一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法。
技术介绍
特定序列核酸的检测在现代生物学和医学中非常重要。目前鉴别特定DNA和RNA序列的用途有很多，包括在法医学中的个人识别，基础生物学和应用医学中的基因和基因组测序，食品和环境样本中微生物鉴定，人类患者中病原体鉴定，癌症和抗药性诊断,疾病进展和药物治疗响应中的遗传预测等。目前核酸检测的方法主要有聚合酶链式反应(PCR)，核酸序列依赖性扩增(NASBA)，环介导等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，滚环扩增(RCA)等。其中PCR方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是核酸检测分析最常用的方法。典型的PCR方法是扩增模板高温变性、引物和扩增模板退火、引物延伸三步反应组成一个循环，经过多次循环反应，使得低浓度的长片段靶标核酸可以被扩增到可检测的水平。但是，短链核酸序列不能直接利用PCR方法进行扩增。因此，一些基于寡核苷酸探针连接的PCR技术便发展起来，例如连接酶介导的PCR方法，该方法一般分为两步。第一步是设计两条寡核苷酸探针均有部分序列与靶标核酸的一半序列互补，当两条寡核苷酸探针退火结合到靶标核酸模板上后，连接酶催化两条寡核苷酸探针间3'端羟基和5'端磷酸基团反应形成磷酸二酯键；第二步是以连接产物为扩增模板的PCR反应。该类方法由于较低的连接效率，导致检测灵敏度低。
技术实现思路
针对现有连接酶介导的PCR方法灵敏度不高的问题，本专利技术的目的是提供一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的高灵敏检测核酸的PCR分析方法。本专利技术的设计思路如下:利用RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法如下:设计两条寡核苷酸探针，其中上游寡核苷酸探针3,末端带有羟基、序列与靶标核酸的一半序列互补；下游寡核苷酸探针5'末端带有磷酸基团、序列与靶标核酸另一半序列互补，3'末端序列为RNA聚合酶启动子序列。当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化上游寡核苷酸探针3'端羟基和下游寡核苷酸探针5'端磷酸基团形成磷酸二酯键，形成的连接产物带有RNA聚合酶启动子序列。含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与连接产物杂交形成具有双链RNA聚合酶启动子结构的转录模板，RNA聚合酶识别此转录模板，合成大量含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针进行杂交，从而启动连接酶进行连接反应。连接产物又可作为转录模板，如此循环，连接更多的寡核苷酸探针，为后续的PCR反应提供了大量的扩增模板。PCR反应中，在DNA聚合酶、正向引物、反向引物等共同作用下，以连接产物为模板，扩增得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下:一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，所述PCR分析方法为非诊断和治疗的分析方法，包括以下步骤:利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化寡核苷酸探针之间的切口连接得到连接产物，所述连接产物含有RNA聚合酶启动子序列；所述含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与所述连接产物杂交，形成具有双链启动子结构的转录模板；RNA聚合酶识别所述转录模板，合成启动子下游的与探针序列互补的RNA片段，所述RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交，介导连接酶催化寡核苷酸探针之间的连接反应；在PCR反应中，DNA聚合酶、正向引物、反向引物和dNTPs共同作用下，以连接产物为模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出所述靶标核酸的浓度。所述的标准工作曲线是由已知浓度的靶标核酸的标准溶液，按照所述操作步骤反应后，实时测定反应体系中的荧光信号强度并得到Ct值，计算空白对照组和实验组的Ct值之差△ Ct值，然后根据标准溶液中靶标核酸的浓度和体系中ACt值制作标准工作曲线。所述靶 标核酸为单链DNA或单链RNA。所述寡核苷酸探针、正向引物和反向引物均为人工合成。所述寡核苷酸探针包括上游寡核苷酸探针(探针I)和下游寡核苷酸探针(探针2)；其中，所述探针I的3'末端带有羟基，且3'端序列与所述靶标核酸的3'端序列互补；所述探针2的5'末端修饰磷酸基团，3'端含有所述RNA聚合酶启动子序列，5'端序列与靶标核酸5'端序列互补。所述连接酶为商品化的DNA连接酶或RNA连接酶。所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。所述连接反应和转录反应体系由A、B两部分构成，其中，A部分包括2~20nM上游寡核苷酸探针，2~20nM下游寡核苷酸探针，2~20nM正向引物，靶标核酸和DEPC水；B部分包括 20 ~500U 连接酶，10 ~200U RNA 聚合酶，100 μ M ~5mM NTPsJP 0.1 ~1.2U/ μ LRNase抑制剂。所述PCR反应的体系包括200~800ηΜ正向引物，200~800ηΜ反向引物，50~500 μ M dNTPs和染料SYBR Green I和连接反应液。所述连接反应和转录反应的步骤为:首先将A部分反应液在80~98°C变性2min，随后降温到20~40°C保持10~30min，然后加入B部分反应液，在20~40°C下反应10~10min ;反应结束后,将反应液置于冰上。所述PCR反应程序为:在80~98°C预变性20~30s ；80~98°C变性5~30s，55~60°C退火和延伸20~60s，进行20~40次循环。本专利技术与传统的连接酶介导的PCR方法相比，具有以下优点和良好效果:1、灵敏度高:靶标核酸存在时介导寡核苷酸探针连接，连接产物带有RNA聚合酶启动子序列。具有持续转录活性的RNA聚合酶以连接产物为模板大量合成RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸介导寡核苷酸探针连接，如此循环实现信号放大，极大地提高检测灵敏度；2、选择性好:当干扰核酸与靶标核酸有单碱基差异时，会直接影响寡核苷酸探针的连接效率，从而造成PCR扩增信号的差异；3、背景信号低:当不存在靶标核酸时，不能进行有效的寡核苷酸探针连接，无法产生后续PCR反应的扩增模板；4、高通量检测:采用八联管或96孔PCR板，可以实现同时制作标准工作曲线和待测样本的检测，减少检测误差；5、操作过程简单快速:操作过程简单，整个检测时间不超过2h ；6、无污染:整个检测过程不需要用到有机溶剂或有毒试剂；7、灵敏度高、特异性强、操作简单、适用范围广等优点，是一种简便实用的分析技术。【附图说明】图1是利用T7RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的PCR方法定量分析DNA靶标的原理示意图；图2是制备得到的 DNA靶标工作曲线示意图；其中，㈧是不同浓度DNA靶标反应溶液的扩增曲线；(B)是不同浓度DNA靶标反应溶液的阈值循环数之差ACt(ACt = Ct，se对照-Ct,DNAtarget)与DNA靶标浓度对数值的工作曲线。图3是特异性实验，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述PCR分析方法为非诊断和治疗的分析方法，包括以下步骤：利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化寡核苷酸探针之间的切口连接得到连接产物，所述连接产物含有RNA聚合酶启动子序列；所述含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与所述连接产物杂交，形成具有双链启动子结构的转录模板；RNA聚合酶识别所述转录模板，合成启动子下游的与探针序列互补的RNA片段，所述RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交，介导连接酶催化寡核苷酸探针之间的连接反应；在PCR反应中，DNA聚合酶、正向引物、反向引物和dNTPs共同作用下，以连接产物为模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出所述靶标核酸的浓度。
【技术特征摘要】
1.一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述PCR分析方法为非诊断和治疗的分析方法，包括以下步骤: 利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化寡核苷酸探针之间的切口连接得到连接产物，所述连接产物含有RNA聚合酶启动子序列；所述含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与所述连接产物杂交，形成具有双链启动子结构的转录模板；RNA聚合酶识别所述转录模板，合成启动子下游的与探针序列互补的RNA片段，所述RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交，介导连接酶催化寡核苷酸探针之间的连接反应；在PCR反应中，DNA聚合酶、正向引物、反向引物和dNTPs共同作用下，以连接产物为模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出所述靶标核酸的浓度。2.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述靶标核酸为单链DNA或单链RNA。3.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针、正向引物和反向引物均为人工合成。4.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针包括上游寡核苷酸探针和下游寡核苷酸探针； 其中，所述上游寡核苷酸探针的3,末端带有羟基，且3,端序列与所述靶标核酸的3'端序列互补； 所述下游寡核苷酸探针的5'末端修饰磷酸基团，3'端含有所述RNA聚合酶启动子序列，5'端序列与靶标核酸5'端...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，尹斌成，于翠媛，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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