本发明专利技术公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法和在催化合成甘油酯型PUFA中的应用，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。其制备方法，包括以下几个步骤：(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；(2)在pH 6.0‑9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。本发明专利技术使用的固定化脂肪酶，相对于游离脂肪酶具有更佳稳定性，可重复性，节约了生产成本；同时酯化效率到达99.31％，而PUFA甘油三酯含量达到92.26％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种固定化脂肪酶的制备及其在催化合成高含量甘油酯型PUFA中的应用技术。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(PUFA)一般是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，主要来源于海产鱼油及植物油脂。目前研究表明具有重要生理活性的PUFA主要有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SDA)、α-亚麻酸(ALA)、γ-亚麻酸(GLA)等。其具有降低人体血液粘稠度，改善血液微循环，降低血中胆固醇和甘油三酯等生理调节功能，目前日益受到关注。甘油酯型的PUFA相对于其他形式PUFA(主要是乙酯型和游离脂肪酸型)具有稳定性强容易被人体吸收，是保健品和药品的最佳产品形式，具有更高的商业价值。相对于化学法合成甘油酯型的PUFA，酶法催化合成方法具有反应条件温和，特异强及环境友好等优点。但目前文献报道的大部分脂肪酶均表现出Sn-1,3位特异性脂肪酶，鲜有非特异性脂肪酶。在实际应用中，由于产物的反馈抑制作用导致PUFA酰基供体的转化率不高、甘油酯中甘油三酯含量低的问题。虽然可以通过延长反应时间或者提高酶添加量来提高产物的量，但会导致生产成本的提高。
技术实现思路
针对现有甘油酯型PUFA制备方法酶催化效率低、底物转化率不高、甘油酯中甘油三酯含量低的问题，本专利技术提供了一种固定化脂肪酶的制备及其在催化合成高含量甘油酯型PUFA中的应用技术。本专利技术中所用的放线菌Streptomyces的脂肪酶MAS1是一种位置非特异性的脂肪酶，而其固定化形式，提高了它的使用频率和寿命，反应的酯化率达到99.31％，甘油三酯含量为92.26％，且结合到甘油三酯中PUFA含量达到92.26％。本专利技术为了达到上述目的，通过以下技术方案实现：一种固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。所述固定化脂肪酶的制备方法，包括以下几个步骤：(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；(2)在pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。所述MAS1脂肪酶与XAD1180树脂按50-75mg/g树脂比例混合。所述磷酸盐缓冲液pH为8.0。所述MAS1脂肪酶与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1。步骤(1)中每一步浸泡后均用水反复清洗至中性后，才进行下一步的处理。所述乙醇、酸和碱分别为95％乙醇，5％盐酸和2％氢氧化钠，浸泡时间分别为24小时，4小时，4小时。所述固定化脂肪酶在催化合成甘油酯型PUFA中的应用。具体为，利用所述固定化脂肪酶为催化剂，PUFA的酰基供体与甘油进行反应，甘油与PUFA的摩尔比为1：(1-5)，酶添加量为112.5-225U/g底物，反应温度为50-70℃，反应时间0-24h。优选地，所述反应温度为65℃，最佳酶添加量为150U/g底物，甘油与PUFA的最佳摩尔比为1:3。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术使用的脂肪酶MAS1为非位置特异性脂肪酶，避免了普通脂肪酶在催化反应中所遇到的转化效率不高、PUFA甘油三酯含量低等问题，其酯化效率达到99.31％，PUFA甘油三酯含量达到92.26％，而常用Novozym 435在相同条件下酯化效率为82.16％，甘油三酯含量只有47.26％。(2)本专利技术使用的固定化脂肪酶，相对于游离脂肪酶具有更佳稳定性，可重复性，节约了生产成本。附图说明图1为起始pH值(a)和酶/树脂比率(b)对酶固定化效率的影响图。图2为固定化MAS1脂肪酶催化反应效果图，(a)温度的影响，(b)加酶量的影响，(c)甘油与PUFA摩尔比的影响。图3为固定化MAS1脂肪酶(a)与Novozym435(b)催化合成PUFA甘油酯效率比较图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。实施例1固定化脂肪酶MAS1的制备1.1固定化树脂的前处理及筛选10g XAD1180/DA201/HP20/HP2MGL/AB8五种大孔吸附树脂分别依次用30mL 95％乙醇，5％盐酸和2％氢氧化钠各处理24h,4h,4h，每步处理后，上清液滤掉，用蒸馏水反复多次洗，直到上清液的pH值为7.0为止，才进行下一步的处理，最后树脂用20mmol/L不同pH值的缓冲液浸泡4h,将滤干后的树脂置于4℃冰箱中保存备用。用乙醇和酸碱浸泡树脂的目的分别是为了赶出大孔中的气泡和除去大孔中残留的单体和化合物。将脂肪酶MAS1酶液50mg/g树脂、等体积的20mM pH8磷酸盐缓冲液和用相应pH值预处理后的树脂按照一定比例混匀，200rpm，30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用相应pH值的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，结果如表1所示。蛋白吸附量的测定采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)。固定化脂肪酶MAS1的酯化活力的测定参照诺维信标准分析方法进行。表1固定化树脂的筛选由表1可知，以XAD1180树脂为载体的固定化脂肪酶具有最大的蛋白吸附量(106.08mg/g)、最高的酯化酶活(2510.06U/g)和比酶活(～23.66U/mg蛋白)，接着是以DA201树脂为载体的固定化酶表现出的特性仅次于XAD1180树脂。虽然AB-8树脂对脂肪酶MAS1的最大吸附量只有67.93mg/g，但其酯化酶活和比酶活与HP20和HP2MGL树脂接近。说明低蛋白吸附量并不意味着低酯化酶活和比酶活。因此，在后续的实验中，选择XAD1180树脂作为固定化MAS1脂肪酶的最佳载体。1.2最适固定化缓冲液pH值固定化条件为：MAS1脂肪酶/载体比为50mg/g树脂，酶液与20mmol/LpH6.0-9.0的磷酸盐缓冲液体积比为1：1，200rpm,30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用相应pH值的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，结果如图1所示。从图1a可以看出，固定化酶的蛋白吸附量在pH6-9范围内没有明显的变化。固定化酶的酯化活性和比酶活均随着pH值的增加，先上升后下降，在pH8时，固定化MAS1获得最大的酯化活力(2712.96U/g)和比活力(26.35U/mg)。在固定化过程中，pH值的变化会影响酶的构象，或促进酶的沉淀(等电点)。因此，选择pH8为脂肪酶MAS1的最佳固定化缓冲液pH值。1.3最佳酶/载体比的确定固定化条件为：MAS1脂肪酶/载体比为25，50，75，100,150mg/g树脂，酶液与20mmol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液体积比为1：1，200rpm，30℃水浴振荡吸附一定时间，抽滤分离载体和上清液，并用pH8.0的缓冲液冲洗固定化酶，再将洗净后的固定化酶于40℃真空干燥8h后，分别测定所得固定化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。
【技术特征摘要】
1.一种固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶为来源于放线菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化载体为XAD1180树脂。2.权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：(1)将XAD1180树脂依次用乙醇、酸和碱浸泡，以去除树脂大孔中的气泡和残留物；(2)在pH 6.0-9.0的磷酸盐缓冲液中，将MAS1脂肪酶与处理好的XAD1180树脂按25～150mg/g树脂比例混合静置，即制得固定化脂肪酶。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述MAS1脂肪酶与XAD1180树脂按50-75mg/g树脂比例混合。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH为8.0。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述MAS1脂肪酶与磷酸盐缓冲液的体...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永华，蓝东明，汪秀妹，杨博，王卫飞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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