本发明专利技术涉及一种稳定和延续甘露聚糖酶活的方法，具体涉及一株B.licheniformis菌体固定化发酵方法，其包括如下步骤：1)菌体的固定；2)菌体的发酵；其中所述的菌体的固定是将B.licheniformis进行以聚乙烯醇包埋固定。本发明专利技术建立了一种可以稳定和延续甘露聚糖酶活的固定化方法，该研究将为β-甘露聚糖酶大规模投入生产提供高产菌株及实践指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种稳定和延续酶活的方法，具体涉及稳定和延续地衣芽胞杆菌甘露 聚糖酶活的方法。
技术介绍
由于β-甘露聚糖酶可以应用到饲料生产、染料脱色等实际生产中，为了适应生产 实际，探索出一种稳定和延续该酶的生产工艺势在必行。随着固定化技术的日益进步，固定 化技术不仅可以将酶、微生物细胞、动植物细胞等进行单一固定化，还可以对多种酶、细胞 以及酶和细胞共固定化。固定化细胞可以避免酶活力损失，降低制备成本，提高稳定性。近 年来，固定化技术已广泛地应用于工农业中如废水处理、农药降解等;能源方面如生产生物 乙醇、有机酸、柴油等;还有食品方面如生产奶、醋、酒等，并取得了许多重要成果，但是在生 产甘露聚糖酶方面的应用目前报道不多。本专利技术选取海藻酸钠法、聚乙烯醇法、卡拉胶法 固定化地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，以β-甘露聚糖酶酶活保留率为检测指 标，筛选出的最佳固定化方法为聚乙烯醇法，对该固定化方法进行条件优化，进而确定最佳 发酵产酶条件并应用到生产性能验证中。该方法的建立可以为菌体固定化在提高产甘露 聚糖酶菌体应用效率方面提供实践指导。
技术实现思路
本专利技术从海藻酸钠法、聚乙烯醇法、卡拉胶法这三种固定化方法中，确定最佳固定 化方法为聚乙烯醇法。并对该固定化方法进行条件优化，确定当聚乙烯醇浓度为2%，菌体 浓度为1:1时，最高甘露聚糖酶酶活保留率可以达到41.93±0.90%，比初始固定化菌球 提高了 18.60%。对优化后的固定化菌球进行最佳发酵条件的研究表明，当魔芋粉加入量为 0.7 %，最佳接种量为1 %，最佳增殖时间60h时，固定化菌球的β-甘露聚糖酶酶活最高，为 838.96±25.791]/11^，利用该条件下制备的菌球进行发酵3211，可以使酶活达到962.37± 15.61U/mL。并且该菌球可以重复使用6次，酶活不变。 终上所述，本专利技术成功建立了一种可以稳定和延续甘露聚糖酶活的固定化方法， 该研究将为甘露聚糖酶大规模投入生产提供高产菌株及实践指导。 本专利技术提供一种地衣芽胞杆菌菌株Β. 1 ichenif ormi s的固定化发酵方法，其包括 如下步骤： 1)菌体的固定； 2)菌体的发酵； 其中所述的地衣芽胞杆菌菌体的固定是将地衣芽胞杆菌菌株B. licheniformis进 行聚乙烯醇包埋固定。 进一步地，步骤1)中菌体的固定是以聚乙烯醇包埋固定，进行菌体固定化，优选， 所述聚乙烯醇浓度为2%-7%(优选为3-5%，更优选为4%)，菌胶比为1:0.1-1:5(优选1: 0.5-1.5,更优选 1:1)。 进一步地，其步骤2)中菌体的发酵是以0.1 %-1.5% (优选为0.5-1.0%，更优选为 0.7 % )的魔芋粉加入量，将1-10 %的固定化菌体接入100mL/250mL魔芋粉发酵培养基，摇床 振荡增殖、发酵。 进一步地，步骤2)中增殖时间为10-100h(优选为30-90h，更优选为60h)，发酵时间 为20-50h(优选为25-40h，更优选为30-35h，最优选为32h)。 进一步地，步骤2)中的发酵次数为1次以上，优选为3次以上，更优选为6次。 进一步地，步骤（1)中的聚乙烯醇包埋固定是将冷却至37°C灭菌后的聚乙烯醇溶 液，与菌体迅速混匀，铺平板，冷冻(_20°C)放置固定，反复冻融三次后(冻融方法为冷冻24h 后取出平板，室温下溶解30min再冷冻(_20°C)24h)，切成小块，再用无菌生理盐水冲洗，即 得到固定化细胞。 本专利技术的另一个方面提供一种提高地衣芽胞杆菌菌株产β-甘露聚糖酶酶活力的 固定化方法，其特征在于，将地衣芽胞杆菌以前述的固定化方法进行固定。【附图说明】 图1为不同菌体浓度对米曲霉β-甘露聚糖酶酶活保留率的影响。图2为不同聚乙烯醇浓度对β-甘露聚糖酶酶活保留率的影响。 图3为不同魔芋粉加入量对固定化菌体β_甘露聚糖酶酶活力的影响。 图4为不同接种量对固定化菌体β-甘露聚糖酶酶活力的影响。 图5为不同增殖时间对固定化菌体β-甘露聚糖酶酶活力的影响。 图6为不同发酵时间对固定化菌体β-甘露聚糖酶酶活力的影响。图7为分批发酵次数对β-甘露聚糖酶酶活力的影响。 图8为固定化菌球的分批重复发酵。1:参照物为直径5mm的黄豆。2:固定化菌球未 发酵之前的颗粒。3:固定化菌球发酵后颗粒第一批分批发酵。4:第二批分批发酵。5:第三批 分批发酵。6:第四批分批发酵。7:第五批分批发酵。8:第六批分批发酵。【具体实施方式】 实施例1、菌株B. licheniformis菌体固定化方法的确定 将菌株B. licheniformis进行聚乙稀包埋、海藻酸钠包埋和卡拉法固定后，以36 °C、摇床转速160r/min、魔芋粉加入量1%、初始pH值7.0、接种量2%进行摇瓶发酵培养12h， 测定其甘露聚糖酶酶活。以酶活保留率多少作为评判标准。结果显示(见表1)，聚乙烯醇 法β-甘露聚糖酶酶活保留率为43.36 ± 1.16%，与其它固定化方法比较差异显著(ρ〈0.05)， 甘露聚糖酶酶活保留率明显高于其它方法，因此最佳固定化方法为聚乙烯醇法，后续试 验将选取聚乙烯醇法对菌株进行固定化并优化其固定化条件。本专利技术聚乙烯醇法未使用硼 盐，方法如下：将冷却至37°C灭菌后的3 %聚乙烯醇溶液，与已处理的菌体1:1 (V/V)迅速混 匀，铺平板，_20°C放置固定，冷冻24h后取出平板，室温下溶解30min再-20°C冷冻24h，反复 冻融三次后，切成3 X 3mm小块，再用无菌生理盐水冲洗3次，即得到固定化细胞，4°C保存备 用。表1三种固定化方法的β_甘露聚糖酶酶活保留率的多重比较 注：按Duncan's新复极差检测(P〈0.05)进行分析，同一列内不同字母表示处理间 差异显著 实施例2、菌株B. licheniformis最佳固定化方法的优化 选择聚乙烯醇浓度为 5 %，菌胶比为 1:1 (1 OmL: 1 OmL)、1: 2 (7mL: 14mL)、1: 3 (5mL: 15mL)、1:4(4mL: 16mL)、1:5(3 · 5mL: 17 · 5mL)进行菌体固定化。 菌体浓度对固定化菌体的β-甘露聚糖酶酶活保留率的影响如图1所示。菌体浓度 1:1 (10mL: 10mL)时β-甘露聚糖酶酶活保留率最高为37.76± 1.97% ;菌体浓度1:5(3.5mL: 17.5mL)时β-甘露聚糖酶酶活保留率最低为21.86± 1.54%。0_甘露聚糖酶酶活保留率随着 聚乙烯醇浓度的增加而下降，当将聚乙烯醇与菌体的比例调至1:2(V:V)时，聚乙烯醇浓度 过低，会导致包埋后呈现液体状，无法凝聚成固体。因此最佳的菌体浓度为1:1 (10mL: 10mL)〇 选择聚乙烯醇浓度为2%、3%、4%、5%、6%、7%，菌胶比为1: l(v/v)进行菌体固 定化。其他条件保持不变，聚乙烯醇浓度对固定化菌球的甘露聚糖酶酶活保留率的影响 如图2所示。在聚乙烯醇浓度4%时，β-甘露聚糖酶酶活保留率最高为55.28±1.14% ;聚乙 烯醇浓度7%β-甘露聚糖酶酶活保留率最低为18.47±1.08%。随着聚乙烯醇浓度的升高， 固定化菌球的β-甘露聚糖酶酶活保留本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地衣芽胞杆菌菌株的固定化发酵方法，其包括如下步骤：1)菌体的固定；2)菌体的发酵；其中所述的地衣芽胞杆菌菌体的固定是将地衣芽胞杆菌进行聚乙烯醇包埋固定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛菁萍，杜仁鹏，平文祥，赵丹，金曼，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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